关于如何正确使用F-4600荧光分光光度计的一点建议

  本文的主要目的是掌握F-4600荧光分光光度计的正确的操作方法，确保仪器的正常运作。此外也列举了一些荧光分光光度计使用中的注意事项。

1.目的：规范F-4600荧光分光光度计的使用，保证仪器的正常运行。

2.范围：适用于F-4600荧光分光光度计

3.职责：质量管理部检验中心、研发部化验员负责本规程的执行。

质量管理部、研发部负责人负责本规程实施情况的监督检查。

4.内容：

4.1 仪器组成

荧光分光光度计，荧光池，配套系统，计算机，打印机。

4.2原理

某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光较长的荧光，物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以做该物质的定性分析。

4.3操作步骤

4.3.1打开光度计左侧的电源开关，仪器前方右侧的运行指示灯和氙灯指示灯亮。

4.3.2仪器启动15分钟后，打开电脑，打开荧光分光光度计工作站，联机工作。在工作站的右侧出现一个绿色的显示为Ready字样的标志，表明电脑与仪器连接良好，可以进行下面的工作。在工作站的右侧出现一竖排的指示，点击“Method”新建一个测定方法。如果之前已经有设定完成的，可以直接沿用。

4.3.2.1 在General选项中，Measuarement有四种选择，分别是①Wavelength scan波长扫描 ②Time scan时间扫描 ③photometry 光度值法 ④3-D Scan 三维扫描。使用者可以根据实验的要求进行方法选择。氯化钠、氯化钾的铝盐测量选用的是photometry光度值法。

4.3.2.2在Operator 选项中输入操作者的名字;Instrument 显示的是联机仪器的型号;如果实验需要测定样品组、设定样品表，则在下面的Coments 空格中进行设定，如果测定过程中有空白，则不需设定样品表，即不选择 Use sample table,而实验过程中每一个样品均需人工操作。

4.3.2.3Quantitation（定量法）界面中的操作

4.3.2.3.1在Quantitation中可选择的定量类型有Wavelength（波长）、Peak area（峰面积）、Peak height（峰高）、Derivative（派生方法）、Ratio（比率）,选择Wavelength（波长）。

4.3.2.3.2在Number of 选项中有：1单波长计算、2双波长计算、3三波长计算的选项，选择1单波长计算。

4.3.2.3.3在Calibration中选择校准类型，选项有：None（无关联测定样品）、1st order（直线）、2nd order（2次方曲线）、3rd order（3次方

曲线）、Segmented（折线法），选择1st order直线模式。

选择None时，在后面的仪器波长设定中zui高可选择6个可设定波长。而选择其他选项时，可设定3个波长。

在Concentration中选择数据单位为%（百分数）。

对Manual calibrate（手工校准）、Force curve through zero（强制曲线通过零点）均可不做选择，又要去时按照标准操作。

Digit after decimal选项中按要求填写十进制小数点后的位数，输入范围为0~~3。处设为0。

下面的Lower concentration 、Upper concentration中设定浓度的下限与上限。此处设定为0~~1000。如果被测浓度高于浓度上限，在Avg Conc 列阵上将出现“H”,如果低于浓度上限，将出现“L”.

4.3.2.4 Instrnment 界面中的操作

4.3.2.4.1Data mode 中有三种数据模式：Fluorescence 荧光强度，Luminescence 发光强度，Phosphorescence 磷光强度。选择Fluorescence 荧光强度。

4.3.2.4.2在Wavelength中选择波长类型：EX WL Fixed 固定的激发光波长，EM WL Fixed 固定的发射光波长，Both WL Fixed固定的的两者波长。实验者根据要求选择Both WL Fixed。然后在下面的空格中填入实验所需要的波长。

4.3.2.4.3 EX:激发光夹缝宽度，EM：发射光夹缝宽度。均选择5nm.

4.3.2.4.4 PMT Voltage : PMT电压。用于控制光电倍增管检测器的电压，从400—700V选择一个数值：400V.

4.3.2.4.5 Auto statistic calc :自动进行数理统计计算。输入数值后设定

须进行计算的样品数，可计算他们的平均值、SD（标准偏差）、CV（变异系数）。设定为2.

4.3.2.4.6 Replicates:设定重复测量的数目，输入范围为1至20.此处设定为1.

4.3.2.4.7 Integration:积分时间。在规定的时间内获得平均的数据值，从而获得稳定的数据。设定时间：0.1s。

4.3.2.4.8 Delay: 扫描延迟时间，输入范围为0-9999s，为实验时点击对话框的确定按键后仪器默认的延迟扫描时间，也可以人为的自己控制速度而不需要设定扫描延迟时间。

4.3.2.5 在Standards界面中选择标准的数量，在下面的空格中选择标准的数量，并设定好标准的浓度等。

4.3.2.6 在Monitor 中设定Y轴的zui大、zui小值。一般zui大值设定为1000，zui小值为0。同时选择 Open data processing window after data acquisition 选项。

4.3.2.7 在Report 界面中，Output 选项中选择Print Report，同时将Print items 下面的选型根据需要进行选择，也可全选。

4.3.3 在设定完方法后，点击“确定”，进入工作站的测定界面。按照工作站的要求测定，前面设定的方法为None 无关联测定样品，首先测定的是对照品。点击右侧的 measure 选项，开始测定。将空白样品放入检测室后，选择左下角的Blank（空白样品）测定。之后将待测样品放入检测室，点击Sample进行测定。每个样品测定两遍，自动计算平均值。之后仪器自动计算并生成检测报告。如果某个样品测定值不稳定，可以选择这个样品的数据后，点击 Remeasure 重新测定。

待测定完成后，点击 End 按键，测定结束。可直接打印报告。也可在关闭工作界面时，将文件保存在固定的文件夹中，方便以后查找数据。

4.3.4 测定完成后，关闭工作站，会显示一个提示界面，如果下面还有其他样品需要测定，可以选择Close the monitor window , but keep the lamp open , 如果测定完成，则选择Close the lamp , then close the monitor window. 这时荧光灯关闭，但是仪器内的风机继续运转，在30 min 后，仪器冷却下来后，关闭左边的电源开关。盖上防尘罩。填写仪器使用记录。

4.4 注意事项

4.4.1 溶剂不纯会带入较大误差，应先做空白检查，必要时应用玻璃磨口蒸馏器蒸馏后再用。

4.4.2 溶液中的悬浮物对光有散射作用，必要时应用垂熔玻璃滤器滤过或用离心法除去。

4.4.3 所用玻璃仪器与荧光池等也必须保持高度洁净。

4.4.4 温度对荧光强度有较大影响，测定时应控制温度一致。

4.4.5 溶液中的溶氧有降低荧光作用，必要时可在测定前通入惰性气体除氧。

4.4.6 测定时需注意溶液PH值和试剂的纯度等对荧光强度的影响。

小结：zui后再提醒下大家检测时所使用的比色皿一定要清洗干净，如果有多个样本不同的浓度，建议由低浓度到高浓度样本你逐个检测，防止清晰不干净带来的误差。