酵母细胞质粒提取步骤和破壁技巧

酵母细胞的细胞壁比较厚，不容易破壁，不如大肠杆菌的质粒容易提取，zui近做了些酿酒酵母的实验，从酿酒酵母中提取质粒，现在就总结下实验的方法和步骤。

酵母细胞质粒提取步骤

1. 接种单菌落（待检测酵母细胞）于25mLYNB（补加氨基酸营养物）培养基中，30℃振荡培养过夜。

2.第二天取一滴菌液于进行显微镜下观察,目镜用16,物镜用40倍观察细胞壁破碎前的状态,其成杆状,流动性比较下.

3.取10ml的培养酵母菌液,5000g离心3min,弃上清液.加入5ml的1倍TE悬浮.

4.将悬浮液倒入高压破壁仪的样品管中,利用高压破碎机进行破碎细胞壁,压力加到20Mpa,停留15s,降压,反复来回压3次.取出细胞液,取一滴于显微镜下观察,如果细胞呈不规则的球状时,而且其流动性 比较大,说明其细胞壁已经破碎成为原生质体.

5.取2个EP管,每管加入1.5ml上述的细胞液,12000g离心5min,收集原生质体.弃取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混匀冰浴5min,进行破原生质体.

6.然后加入150ul的tris饱和酚,和150ul的卤仿异戊醇混合液（卤仿:异戊醇=24:1）,混匀,12000g,离心10min.

7.将水相移到另一EP管中,加入等体积的卤仿异戊醇混合液（卤仿:异戊醇=24:1）, 混匀,12000g,离心10min.

8. 将水相移到另一EP管中,加入1/10体积的3M KAC溶液和2倍体积的无水乙醇,放入-20℃冰箱中

9.1h,12000g离心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的无水乙醇,混匀,12000g,离心10min.

10.弃去乙醇,等室温干燥后,每管加入20ul的TE溶液（如要去处RNA酶,加入1ul的100mg/ml浓度的RNA酶）,放入-20℃冰箱即可.

11.跑电泳进行检测是否从酵母菌中提出质粒了.

酵母破壁方法

我给你介绍两个必叫简单点的酵母破壁方法，非常实用，我作过很多实验，这两个方法是我自己总结出来的，希望对你有用。

酵母的细胞壁比较厚,不易破，而且细胞壁中含有的一些成分容易影响以后的实验，所以破壁的步骤非常关键!其他步骤只要你按照说明就可以了。

1. 酚氯仿剧烈振荡方法破壁：培养好的1ml酵母细胞在STE溶液中洗涤两次后，用70ulTE缓冲液重旋!加入50ul玻璃珠（sigma公司），加入80-100ul酚氯仿，剧烈振荡5-10分种后，使用氯仿抽取去除酚和蛋白，然后按照其他步骤沉淀就可以得到你的质粒，DNA的提取也可以使用这种方法。

2.反复冻融破壁：培养好的1ml酵母细胞在STE溶液中洗涤两次后，加入200ul缓冲液[2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl （pH 8.0）, 1 mM EDTA （pH 8.0）]，使用液氮和96-98度沸水反复冻融3-5次，然后使用酚氯仿抽提蛋白!其余步骤参考其他文献

3.下面两个文献对你会有所帮助!请参考!不错的方法!

For yeast plasmid extraction we use the following method:

Buffer A: 100 mM NaCl 10 mM Tris-HCl （pH 8） 1 mM EDTA 0.1 % SDS

1. Culture the plasmid-harboring cells overnight in 1 - 2 ml of medium. Cells with 1 - 4 OD600/ml are needed.2. Pulse 5-10 sec at 15'000 rpm （maximum speed） （in an Eppendorf tube）.3. Throw away the supernatant.4. Resuspend in 200 µl of buffer A, keep cells on ice.5. Add glass beads just before the solution surface, mix with a vortex during 1 minute and sonicate.6. Add 200 µl of phenol.7. Vortex another minute.8. Centrifuge at 15'000 rpm for 1 minute.9. Throw away the phenol phase.10. Add 200 µl of phenol and reextract the same way.11. Take the water solution （about 200 µl） which contains the plasmids and treat with Glassmilk: add 600 µl of NaI solution and 5 µl Glassmilk suspension, put the tubes on the wheel for 5 min., then pellet the Glassmilk/DNA complex （pulse 5 sec）, remove the supernatant and set aside, then wash the pellet 3 times with 300 µl New Wash, then pulse for 5 sec to remove the New Wash.12. Elute the DNA into water （20 µl） or TE buffer.

When not using the GeneClean-kit, another protocol can be applied:Steps 1 to 9 remain the same as above. Then:

10. Add 200 ml phenol/chloroform 1:1 and vortex.11. Centrifuge at 15'000 rpm for 1 minute.12. Throw away the phenol phase.13. Add others 200 µl of chloroform and reextract the same way.14. Take the water phase and adjust the volume to 400 ml with water.15. Add 40 ml 3M NaCl.16. Add ca. 1 ml of ethanol 100 %.17. Put the tube at -20 0C for about 10 min..18. Centrifuge at 4 0C for 10 min. at maximum speed.19. Throw away the supernatant.20. Wash the pellet once with ethanol 80 % and once with ethanol 100 %.21. Dry the pellet by putting the tube upside down on a Kleenex.22. Resuspend the pellet in 50 ml TE buffer.

酵母质粒提取可以用试剂盒提取，也可以直接用裂壁酶处理后采用碱裂解法提取质粒，缺点就是提取的量很少，还会容易出现假阳性现象，明明有却条带，检测却不正确。