总RNA抽提实验操作技巧和步骤

[实验原理]

Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品zui大使用量（1ml Trizol），动物组织（ 50mg），植物组织（100 mg），丝状真菌（ 100mg），动物细胞（5×106～1×107），酵母（1×107） 。

TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb （28S）和~2 kb （18S），低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 （tRNA, 5S）。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8 。

[实验用品]

【实验耗材】

1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl。酒精擦拭，头部重点，紫外线照射。

2、吸头：1ml、200μl、20μl

3、匀浆管：5ml

4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个

5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

6、试剂瓶：2个60ml的棕色广口试剂瓶。小瓶（分装无水乙醇，高压的DEPC水，-20°C保存）。

7、量筒：50ml、250ml、500ml

8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

9、试管架：5ml、1.5ml、20μl

10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水

11、铝制饭盒：4个

12、塑料小饭盒：1个

13、大瓷缸：2个

14、锡泊纸：一卷

15、卷纸：2卷

16、三角烧瓶：带盖，稍大（融琼脂糖）

【实验仪器】

天平、振荡器、高速离心机、0.5～10ul、20～200ul、100～1000ul加样器。

【自备试剂】

DEPC（焦碳酸二乙酯）,氯仿，异丙醇，无水乙醇，0.05～0.1%DEPC-H2O，75%乙醇，TE缓冲液，琼脂糖。

RNA抽提的准备工作

【试剂配制】

1.DEPC水： 1ml+1000ml双蒸水=1‰ DEPC水，1000ml容量瓶中静置4小时。

2.75%乙醇：无水乙醇+DEPC水，-20℃保存（DEPC水需先高压）

3.氯仿：棕色瓶

4.异丙醇：棕色瓶

【器具处理与准备】

1.塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）

先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，小枪头需打入DEPC水，室温过夜，高压，烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）。胶塞同样处理。塑料器皿也可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水*漂洗干净后高压灭菌备用。

2.玻璃制品：

泡酸过夜，冲洗干净，1 ‰DEPC过夜，蒙锡纸，150°C烘烤4h，180°C，2h。或泡酸过夜，冲洗干净后高温烘烤，1 ‰DEPC过夜，高压。盛装乙醇，DEPC水用。

3.匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）

[实验内容和方法]

一、抽提

（一）组织抽提

1.组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。实验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥发将粉末转移到EP管，室温5000rpm离心去上清。每50-100mg组织，加入1ml Trizol。

2.若是新鲜标本经匀浆后转移离心管，加入1ml Trizol。

3.若组织量（1～10 mg）或细胞数很少（102～104），在样品中加入800 ul Trizol反复抽吸均匀，再加入糖原（终250ug/ml）,剧烈振荡或用匀浆器匀浆。

4.在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60～70°C保存至少一个月。

（二）细胞抽提

1.倒掉培养基，PBS洗，直接将1ml Trizol 注入培养瓶（5×106），反复抽吸均匀。

2.或收集细胞后加入Trizol 反复抽吸均匀。

二、分相

3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿（为Trizol总体积的1/5）,振荡混均30秒，室温下静置5分钟.

4. 12000 rpm 15分钟4°C,分相为三层。上层：RNA（约为Trizol的60%）;中间：DNA;下层:蛋白质（酚-氯仿）。

5.小心吸取上清液，转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4～0.6 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。

三、RNA沉淀

6.上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静置10分钟。

7.离心12000rpm 10分钟4°C。

8. RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃RNA沉淀。

四、RNA清洗

9.离心管加入1ml 预冷的75%乙醇（1mlTrizol至少1ml乙醇清洗DNA）,振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，室温12000rpm×1～2分钟。（有文献称不超过7500g离心）。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75%乙醇中，RNA在4℃至少保存1周，-20℃至少保存1年。

10.室温选择流动性小，倒置离心管于滤纸上，干燥RNA，但不能*干燥（5～10分钟）。用DEPC水15μl溶解沉淀，55-60℃孵育10～15分钟。

11.测量OD值后，样品放置-70℃保存，一个月

五、RNA、DNA浓度的计算

取78μl DEPC水加2μl 第10步液体，则稀释倍数为40倍。

【RNA】=A260 X 40 X n/1000μg/μl

【DNA】=A260 X 50 X n/1000μg/μl（n为稀释倍数）

分离RNA的理想效果是A260/A280=1.8～2.0

A260代表RNA OD值;A280代表蛋白OD值

[注意事项]

1. RNA产量：每1 mg组织或1×106培养细胞预期的RNA产量

（1）肝和脾，6—10μg

（2）肾，3—4μg

（3）骨骼肌和脑组织，1—1.5μg

（4）胎盘，1-4μg

（5）上皮细胞（1×106 ，8—15μg cultured cells）

（6）纤维母细胞（1×106 ，5—7μg cultured cells）

2.电泳检测: 制备甲醛变性，1%琼脂糖凝胶快速电泳，25ug/lane，65V，2.5h，检测RNA分子完整性，观察18S、28S条带。

3. RNA沉淀*干燥，会地降低可溶性。部分溶解的RNA其A260/280比值<1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶解RNA，并在55～60°C下孵育10分钟，当RNA以后要用于酶切反应时，避免使用SDS。

对于胰腺，肾等组织中RNase含量很高，沉淀用去离子甲酰胺溶解，–70°C保存。

4.分离RNA的理想效果是A260/A280=1.8～2.0

【分离胶范围】<500bp 1.2～1.5%

>10 kp 0.3～0.7%

二者之间 0.8～1.0%

【分析和定量】紫外分光光度计测定A260及A280来定量分析RNA的纯度及浓度。用什么稀释的RNA，就用其调零。

5.预防RNA酶污染

6.在分相步骤吸取上清液过程中，和清洗步骤吸弃上清液过程中，都应在不触及其他相或沉淀的前提下吸取尽可能多的上清液。

7.台式离心机zui大能达到2,600×g的离心力，如果将离心时间延长到30-60分钟可以满足操作。

8.当TRIZOL用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。TRIZOL用量较大时，可以使用玻璃试管（Corex）或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。 离心前小心平衡试管。离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧。

9. 用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。

【疑难解答】

一、无RNA沉淀

1. 匀浆不*：匀浆不*时，基因组DNA分子仍然很大，溶液粘稠。变性的蛋白质和基因组DNA一起形成絮状凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地释放到溶液中。

2..沉淀不*：从小于2×105动/植物细胞、小于2mg动物组织、小于4mg

植物组织或RNA含量低的动/植物组织中提取RNA时，匀浆体积太大，将造成RNA过分稀释而不能沉淀下来。当从这样的样品中提取RNA时，应按比例减少抽提溶液。

二、抽提率低

1. 系统超负荷：如果过多增加单位体积内的样品量，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不*、单位体积内的DNA和蛋白质所占比例增大，使RNA不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难，降低RNA沉淀效率.

2.样品均化或裂解不*: 匀浆不*时，RNA分子易被蛋白质和基因组DNA复合物包裹，不能被有效释放。

3.终RNA不*溶解:未溶解的RNA丢失。

4.样品未及时处理或细胞生长过度：样品分离后短时间内细胞内RNA酶被激活，细胞生长过度同样会激活细胞内RNA酶，若不及时提取RNA，大部分RNA会被降解。若样品暂时不作RNA提取，应立即用液氮冷冻*，置-80℃贮存。

三、A260/A280 比率 <1.65

1.在分光光度计测量前用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。

2.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。

3.匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。

4.分离的水样层中污染有层。

5.终RNA没有*溶解。

四、RNA降解

1.从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存。

2.用于抽提的样品，或抽提的RNA样品保存于–5—–20°C，而不是存放于–70°C。

3.细胞经消化而分散。

4.水溶液或试管污染有RNA酶。

5.用于琼脂糖凝胶电泳的福尔马林pH低于3.5。

6. RNA在水溶液中呈酸性，易自发水解，应溶于TE，-20℃以下保存。?

五、DNA污染

1.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。

2.用于抽提的样品包含有机溶媒（如乙醇，DMSO），强缓冲液或碱性溶液。

六、蛋白多糖和多糖污染

下述的对RNA沉淀方法改进能从抽提的RNA中移去复合污染。以匀浆化时每1 ml TRIZOL为例，在水样层中加入0.25 ml异丙醇后再加入0.25 ml的高盐溶液（0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl）。将终溶液混匀，离心并继续进行前述的抽提操作。改进后的沉淀法能有效地析出RNA而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在溶液中。对于含有大量多糖的植物，要抽提其RNA将改进后的沉淀法和在zui初匀浆化时多加一次离心（RNA 抽提指南，可选方案）合并使用是十分必要的。

另外，关于实验所用的细胞，如果有新鲜的就用新鲜的，因为使用冻存过的细胞实验结果会比较差。如果没办法马上进行RNA提取实验，建议先加入抽提试剂将样品裂解之后在细胞冻存。