技术讲解：siRNA转染详细步骤

 A.siRNA转染的方法

哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前zui常用的转染方法。

应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面：

1. 转染试剂的用量

2. siRNA的用量

3. 转染时的细胞密度

4. 转染时的操作顺序

5. 细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间

B. SiMi Transfection Reagents 转染试剂

选择的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。SiMi Transfection Reagents适用于核酸的体内和体外操作，可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染，也可应用于DNA/siRNA的共转染操作;是一种新型的siRNA转染试剂。

SiMi Transfection Reagents的应用领域：

1. 原代培养细胞和转化细胞株的基因转染

2. siRNA高通量转染试验

3. DNA转染;DNA和siRNA的共转染

4. 核酸（siRNA、DNA、RNA）的体内导入试验

5. 贴壁细胞和悬浮细胞转染

SiMi Transfection Reagents 的特点：

1. 不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作

2. 在含血清培养基中也能表现高转染效率

3. 细胞毒性低;适用细胞广泛

4. 即用型试剂，可在含有抗生素的*培养基中转染

5. 基于脂质的转染试剂，确保没有RNAse活性

6. 可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的导入

C.SiMi Transfection Reagents适用的细胞类型

SiMi Transfection Reagents转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如：HeLa（人颈部癌细胞）、MCF-7（人乳房癌细胞）、Hep3B（人肝细胞癌细胞）、COS-7（猴肾细胞）、Neuro-2a（鼠神经母细胞瘤细胞）、NIKS（人角质化细胞）、B16（鼠黑素瘤细胞）、DLD-1（人结肠癌细胞）、NIH/3T3（鼠胚胎成纤维细胞）、HT-29（人结肠腺癌细胞）、A549（人肺癌细胞）、CHO-k1（仓鼠卵巢细胞）和293（腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞）,SVRbag4细胞等。

D.转染前细胞培养

在细胞板上培养细胞时，应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。

E. 合适的SiMi Transfection Reagents用量

合适的siRNA（DNA）：lipofetamin2000比例对核酸的转染有重要影响;我们的DNA：lipofetamin2000为1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：SiMi Transfection Reagents为1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情况下，此范围内都可获得高的转染效率。

F.贴壁细胞转染程序

选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。siRNA（DNA）和SiMi Transfection Reagents的用量和两者的比例可在范围内适当调整。

1. 转染前一天，4-5?104细胞接种在24孔板上， 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培养基）细胞培养基。

2. 选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。

3. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清培养基加入20pmol siRNA（或0.8μg DNA），柔和混匀;

4. 混匀SiMi Transfection Reagents试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl SiMi Transfection Reagents试剂（DNA转染时，则加入2μlSiMi Transfection Reagents试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟;

5. 将稀释好的siRNA和SiMi Transfection Reagents试剂混合;轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）复合物。

6. 将100μl siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板。

7. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。

G.悬浮细胞转染程序

1. 转染的当天，收集细胞离心，用含FBS的培养基重悬。

2. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清的培养基加入20pmol siRNA（或0.8μg DNA），柔和混匀;

3. 混匀SiMi Transfection Reagents试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl SiMi Transfection Reagents试剂（DNA转染时，则加入2μl SiMi Transfection Reagents试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟;

4. 将稀释好的siRNA和SiMi Transfection Reagents试剂混合;轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）复合物。

5. 再加入400μL细胞悬浮液（细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间）。

6. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。

<, FONT, face="Tahoma">H.DNA和siRNA共转染细胞程序

1. 在转染的前一天，4-5?104细胞接种在24孔板上，0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。

2. 选择用于初期接种的细胞密度，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。

3. 在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl SiMi Transfection Reagents试剂，充分混合，放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents复合物。

4. 将siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents复合物加入培养基中，轻轻混匀。

5. 细胞在37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它步骤。

I.siRNA体内导入方法

1. 适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混匀，因为注射液体积有限，建议采用高浓度的siRNA或DNA，一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。

2. 取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与SiMi Transfection Reagents混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的SiMi Transfection Reagents（24μg）和0.45μL不含RNA酶的无菌水中，将1#管中的溶液加入2#管中，在室温下温育30分钟，以形成siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagents复合物。

3. 制备的siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagentse复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。