士锋生物转化步电穿孔法进行质体实验

仪器用具：

37℃培养箱及冰浴

Electroporation cuvette （electrode gap, 0.1 cm）

Electroporator （Bio-Rad, IBI geneZapper 或其它厂牌）

药品试剂：

无菌水 （置冰浴中）

10% glycerol （置冰浴中）

SOB 液体培养基

SOB 固体培养基

SOC 液体培养基

SOC/Amp 固体培养基

大肠杆菌JM109

Ligation mixtures

方法步骤：

菌体的处理：

1） 进行转形实验的前16~20 h,将菌种JM109 接种在SOB 固体培养基上，并在37℃培养箱中培养。

34 Methods in Biotechnology Vol 1

2） 取80 mL SOB培养基装入250 mL灭过菌的三角瓶。 另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选8 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入80 mL SOB中，于37℃震荡培养约2~3h,直至细胞数约为4~7×107/mL.

3） 收集菌液于离心管中，置冰浴中10 min.

4） 以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。

5） 倒去上清，并尽量将液体倒干，或以微量移液器头吸干净。

6） 沉淀加入80 mL 冰冷的无菌水，稍加震荡，混合均匀后以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。

7） 倒去上清，菌体再依序以40 mL 及1.6 mL 无菌水同法处理。

8） 菌体以0.16 mL 冰冷的10% glycerol 悬浊。

9） 菌液每80 μL分装一管，可直接用于electroporation,或以液态氮或干冰快速冻结后置 -70℃贮存。

Electroporation:

1） 进行electroporation 的DNA 样品溶液中离子强度不可过高，DNA 需先经过透析或以酒精沉淀处理。透析可如2.3.1 节步骤15） 进行。

2） Cuvettes 自包装中取出后，置冰浴中至少5 min.

3） 将菌液置于冰浴中，加入DNA 样品，混合后，小心将溶液吸至cuvette 的凹槽中，将cuvette 置冰浴中。

4） 进行electroporation 时，将cuvette 由冰浴中取出，将四周水份擦干，置于反应槽中，并接上电极线。

5） 以2.5 kV, 21 μF 进行electroporation.

◆ 注意!高电压!

6） 取出cuvette，立即加入1 mL SOC.

7） 吸出菌液移至微量离心管中，于37℃震荡培养45 min.

8） 取200 μL 菌液涂布于SOC/Amp plate.置37℃培养16~20 h.

9） 观察plate 上菌落的形状并计算菌落数。