细胞培养经验

培养基

1、关于培养基，如果不是买液体的，那么其ph问题一定要给予充分重视！配置过程中的调解我就不说了，能用ph计！

2、关于培养基的保存，如果你有输液瓶，那么我建议你每一次打开以后，还是换一个胶塞。如果象我一样就是普通培养瓶，那么记得一定要用封口膜封口，不要担心封口膜会带来更多的污染！你可以先将封口膜在使用前开紫外时略微照一下！但是保存封口膜找一个密封的瓶子等，比如吃完糖的罐子。

3、培养基中还是加好所需血清保存，这样使用比较方便。当然不是所有的培养基，而是2周左右可以使用完的量啊！

传代：

1、细胞传代的时候量要做到zui少但是有效果就可以，这样对细胞的伤害时zui小的。我一般加入的量恰好将将够铺满整个瓶底。另外消化完成也就是晃动瓶子时有沙粒状大片脱落，需马上加入含有血清的培养基中止消化！有人这样直接传代，我认为效果不是很好，因为这时血清被用来种子且瓶中还有损伤的细胞，所以我还是一贯主张离心完在传代。

2、既然说到了离心，那么一定要平衡你的培养瓶。关于离心机平衡的重要性我应用下面这个帖子吧。原载于 散人笔记 原文地址 http://www.eryi.org/blog/post/centrifuge-rpm-to-rcf.html

3、离心完以后去掉旧的培养基，加入新鲜培养基（含血清）。然后用滴管一定要吹打均匀在传代！！！我在培养HEPG2此种细胞不易消化且不易分散，但是成团对其影响很大。

4、首先要充分判断传代的时机了，一般来说至少长到80％左右（我一直在培养肿瘤细胞）。我一般是2～3天就能传了。记住细胞可以*张满瓶底甚至已经重叠在传，但是不要还没有长到一定的规模就传代！这样很容易损伤细胞，当然不同的细胞不好用时间来限制，但是一定要显微镜下观察好了在决定是否传代。需要注意的是使用pbs先清洗一下细胞，以消除原来培养液种血清的干扰。

5、一般来说传代前一天或者上午至少应该更换半量培养基，这样可以保证传代的细胞仍然保持旺盛的生命力，使其不会因传代受到更大的损伤～

6、关于传代是否使用，我想因细胞各异。如果使用，我建议的量一般是600ul左右，这个是指100ml玻璃培养瓶，肿瘤细胞而言，一般就是刚刚可以将瓶底覆盖为好。量不要过大，以免对细胞损伤过大。

7、肉眼观察在轻轻晃动培养瓶的时候发现细胞呈沙粒状一片一片的滑落开始中止消化，我一般直接加入含有血清的培养基，然后滴管轻轻吹打混匀，转移至玻璃离心管，800rpm，6分钟左右。离心结束即可看见大量白色细胞聚集在离心管底部。

8、离心以后弃掉旧的培养基，换新培养基，然后吹打混匀。一般一瓶细胞数量是600万左右，也就是6*106个，但是我平时传代是不计数的，只有铺板的时候才计的，但是凭经验而言，一瓶传2瓶是没有任何问题的。这里需要指出的是，原来培养细胞的瓶子如果你操作得当还是可以继续使用的。

9、一般而言传代24h后换一下培养基。虽然细胞在4h左右基本可以*贴壁，但是我们还是需要让他在这个初始环境下生长适应一下。

培养瓶的清洗和灭菌.

1、本人觉得尤其是新手，恐怕*关就是清洗培养用品了。一般而玻璃用品的办法就是充分泡酸，就是硫酸和重铬酸钾一定比例的洗液。时间来的及就尽量多放一段时间，特别管用的。但是要记住将瓶子内部充满洗液，并且充分接触。

2、泡过洗液的瓶子等玻璃仪器，包括离心管和胶头滴管等，这时候就要用自来水冲洗，直到没有洗液残留；接下来就是蒸馏水冲洗了，整个过程至少是5次吧，自己感觉就可以了，一定记得带上橡胶手套啊～

3、洗干净的瓶子等放入烘箱干燥，是带有鼓风的烘箱，而不是真空的啊！这样可以节省好多时间。

4、瓶子干了以后，用铝箔或者牛皮纸扎紧瓶口，在鼓风烘箱中160-18度干法灭菌4h，这里的4h一般是指温度升到160度左右开始的，而不是指放入烘箱哪一刻就开始计时。这里特别注意灭菌结束以后不要立刻打开烘箱门，以免质量差的瓶子突然接触冷空气而炸裂伤人。而是等到烘箱降温到身体可以接受的温度在将其拿入细胞室，这样灭菌的瓶子至少可以使用10天的。当然一定将瓶口扎紧啊！！！

5、实验中，也有人使用灭菌锅灭菌玻璃瓶子等，这也能达到灭菌要求，但是高压灭菌结束干燥的时候不是很容易！我使用干法灭菌。

6、这里需要指出的胶头滴管的灭菌是，将其放入到不锈钢杯中，一般很容易定做的。杯子下面放好用纱布包好的棉花，滴管上边用棉花塞好，不要特别紧以免滴管不好用；也不能特别松，要不会将棉花吹落的。

7、玻璃离心管灭菌方法和培养瓶方法是一样的，但是就是用饭盒或者别的器皿装好离心管，这里的离心管也是包扎好瓶口的。

MTT实验

1、大家应该明白这个实验的原理（论坛里面很多，不重复.......），简单一句话就是：只有活细胞才能与mtt反应，并且能够产生有紫外吸收的晶体，也就是吸收度反应的是活细胞的相对数量，而不是数量！！！

2、做mtt的准备：应该先设计好实验，比如药物浓度，还有接种密度和接种体积，这2点相当重要。因为你设定的药物浓度有可能不是你zui终的作用浓度（如果你不换液的话），并且需要注意接种密度太大，很可能让你的实验一塌糊涂；如果你的接种密度太低，也有可能产生假阳性，造成盲目的乐观啊！还有就是给药时间，这个你应该在充分掌握你自己细胞生长装态的情况下确定，当然有条件的可以做个流式或者细胞生长曲线来定！

3、关于配药，我主要想说的是极性小的药物，也就是水溶性或者培养基基本不溶的样品，那么需要加入有机溶剂，这时你就必须设定阴性对照，依据给药组的有机溶剂zui大含量对阴性对照组给予相应的有机溶剂。举个例子：假设1mg药物溶解于500ulDMSO，然后稀释到5ml，那么相应的阴性对照组DMSO的含量就应该是500ulDMSO/5ml。