正常小鼠原代骨骼肌细胞培养

正常小鼠原代骨骼肌细胞培养
 
一、实验试剂
1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、检测试剂：鼠抗人及大鼠desmin一抗，肌球蛋白（myosin）单克隆抗体
 
二、实验器械
1、培养皿
2、培养瓶
3、直剪和眼科剪
4、和
5、烧杯
6、15ml离心管
 
三、实验流程
取肌肉于平皿，Hank’s洗3次
↓
剔除脂肪、结缔组织
↓
肌肉标本剪约0.1cm3小块
↓
移至离心管，Hank’s洗3次
↓
静置1min，弃去上层液及漂浮组织
↓
0.25%，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次
↓
生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200，400目过筛
↓
离心，1000rmp,10min，弃去上清
↓
重悬，计数细胞，接种密度以5 × 105 个/ml
↓
悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h
↓
转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37℃，5%CO2
↓
4d换液，以后每天换
 
四、实验 操作
 
1、  新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank’s洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块；
2、  将剪碎的肌肉移至离心管，Hank’s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织
3、  向上述离心管中加入0.25%，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；
4、  反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min；
5、  弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d换液，以后每天换液1次。
 
五、细胞鉴定
 
1、显微鉴定：刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。12h后，细胞开始贴壁，72h后贴壁*，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列。当细胞融合80%以上后，开始形成肌管。
 
2、免疫细胞化学染色1：肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白（desmin），可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。
 
3、免疫细胞化学染色2：采用骨骼肌特异性的肌球蛋白（myosin）单克隆抗体检测。取含骨骼肌细胞盖玻片常规处理后进行myosin的细胞免疫化学染色，PBS代替一抗做阴性对照。结果判定：以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。
 
六、注意事项
 
1、消化过程中，也可采用15min两步消化的方法进行。根据所取组织个体年龄决定，一般成年大小鼠采用两步消化效果好，幼鼠一步消化和两步消化差别不大。
 
2、传代培养代数不要太多，骨骼肌细胞传代能力有限，容易死亡。
 
3、骨骼肌细胞培养过程中，形态会发生较大变化。
 
4、肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织。