蛋白质双向电泳过程与体会

双向电泳IEF (sigma) IEF（not IPG）/SDS-PAGEzui简单的装备如下，适合于没多少money做IPG又想做“热"的所谓蛋白质组的.

IEF用Biorad的圆盘电泳槽（不行用国产的吧，不），SDS-PAGE用六一厂的就可以了(六一的，买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧）

BIO－RAD 的圆盘电泳槽，国产的不，因为上槽Biorad 的铂金丝凹进去了一点，不是很进去，而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈，影响电聚焦。

双向电泳

蛋白质样品制备

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存 。

2 蛋白质浓度测定

按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。说实话，好象Bradford法不太好做 。

2.3.1 电聚焦（IEF）

2.3.1.1 玻管准备

干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上。电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml 的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的处理，先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1 个小时，中间换3，4 次水，可多泡一会。zui后泡在无水乙醇里 面1hr，轰干就可以用了.

2.3.1.2 凝胶制备与电聚焦灌IEF的配方为

3.09克尿素

1.125 ml 10%NP-40

1.125ml 水

0.735ml 30%屏息现案 (ACR 28.38 BIS 1.62)

0.15 ml Am 3.5-10

0.375ml Am 5-7

8卫生 10%AP

1.8卫生 TEMED

用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间好一些，我一般是头天下午灌胶，第2 天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80μg，上面再小心加入50m mol/l NaOH至管口,不要破坏样品与NaOH 的界面。即可进行电泳。电极液为：上槽（负极）为50m mol/l NaOH 液，下槽（正极）为25m mol/l H₃PO₄。按200V×15min，300V× 30min，400V×18h，1000V×1h的程序进行电聚焦。或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑*向一定要在保持在37 度左右,特别是冬天,我的方法是 温控仪控制 暖风机 在37 度 暖风机和电泳槽在一个大的纸箱(密封)里.呵呵,应该可以想象得到吧,*向温度特别重要,不然,电聚焦肯定做不好。

2.3.1.3 电泳后的凝条处理

电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽，有时候你会唱 想哭却又哭不出来，呵呵，熟悉了就快了，注射器 枪头 玻璃管必须为一直线，消息不要把注射器的头搞断了。取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成0.5cm 的小段，各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的pH值，以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标作图，即为等电点标准曲线。漫漫挤,管子,200 卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200 卫生枪头,保证水不从枪头和管子处流出来, 注射器顶在胸前把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久，想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑。绝招哦,不要随便乱传,嘿嘿！还可以马上看一下,胶条上有蛋白质没有,有的话一下就可以看见了。那些说什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵！就跟你用考染IEF 胶条一样的,带,可能先在12%的TCA 里面看不见,不过你再把它放在水里面,泡一会带就出来了。不过在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要换至少5 次水,每次用不同的小平皿。

注意到下级液磷酸部分的胶条没，是不是有一节约2cm左右，比较突出，没有膨大的部分呀！只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢，大约3cm左右，呵呵!

对要进行第二向SDS-PAGE 的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%β－巯基乙醇，0.1%溴酚蓝]进行二次平衡，*次20min，第二次25min。第2 次的溶液为新的。一般我是把第2次用过的当成*次的用 。平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。

2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

选用DYY-Ⅲ型（北京六一仪器厂生产）电泳槽（规格为200×200×1mm），分离胶浓度为12%，无浓缩胶。待胶聚合后，将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端（避免胶条拉直），并用1%琼脂糖（电极缓冲液配制）封胶，特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮。61厂板子之灌胶：坚决不用凡士林，用透明胶将两端（板子的2 边）封住，再用2%琼脂之SDS-PAGE 电极液封底，待琼脂凝固后再灌胶，zui后用水封胶。over！

做之前，一定要保证，1，灌胶不会有任何问题，不能漏，2，不用浓缩胶，只用分离胶。3，分离胶用水封，要保证凝聚好的PAGE 胶，为一平的线，凹来凸去的就不要用了。玻璃版能用硅化剂不过了。防止从边上漏，我用透明胶（约4cm宽），封住两边，下面还是用2％的琼脂封。灌好电极缓冲液[25m mol/LTris，192m mol/L 及0.1%SDS]，按25mA/板胶恒流进行电泳，待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳，一般电泳耗时约4-5h。银染：凝胶于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者过夜；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min； 0.02%1min；水洗3×20s；0.2%，0.02%甲醛快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;0.2%，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%)快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%)显色到你所希望的程度,自己看,背景好,点又多的话就可以了；水洗20秒；0.05%停显。染色理想温度：我去年4,5月时,通常染色都定在中午,12点多;温度是20 度左右,(这个温度我也没控制的)TCA领一瓶TCA 500g的那种 按分子克隆上的好象是直接加200多ml 水就成TCA了10%TCA, 0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:

TCA 10ml

2-ME 0.07ml

丙酮 90ml

0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:

2-ME 0.07ml

丙酮 100ml

0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)

50ml

Urea 28.5g

NP-40 1ml

Ampholine 5~7 2.0ml

3.5~10 0.5ml

2-ME 2.5ml

注意定容！配好后用1.5ml 管分装！-70度保存

注意 这两个溶液 配的时候 比如配 50ml 用100ml的烧杯 用量筒量50ml 水 倒如烧杯里面，用记号笔标上刻度，然后把水倒掉，再称 尿素 小量加水，因为尿素加水后体积会变大，再37 度水域锅里溶，然后加其它成分，zui后再定到50ml

(2002-10-30 18:39:37)

UKS液 (含9.5M Urea, 5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)

25ml 50ml

Urea 14.25g 28.5g

K2CO3 17.25mg 34.5mg

SDS 0.3125g 0.625g

DTT 0.125g 0.25g

2-ME

Ampholine(3.5~10) 1.25ml 2.5ml

Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2 枪，4枪)

2-ME 可适当加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存