Western Blot免疫印迹实验操作规程

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

一、原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针"是抗体，“显色"用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、试剂准备

1. SDS-PAGE试剂:见电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH₂O 2.8ml。

3. 转膜缓冲液： 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH₂O定容至1000ml。

4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na ₂HPO ₄ 1.44g；KH ₂PO ₄  0.24g；加ddH ₂O至1000ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH ₂O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6. 显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H₂O₂ 1.0μl。

三、操作步骤

1. 蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。

2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

3. 转移：（半干式转移）

① 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

② 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

③ 转膜：转膜装置从下依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm² ，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

四、免疫反应：

1. 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。

2. 加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

3. 弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

4. 加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

5. 弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。

6. 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M  PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。

7. 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

8. 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

四、注意事项

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定*条件。

2、显色液必须新鲜配置使用，zui后加入H₂O₂。

3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。