基因芯片实验中的细胞和组织制备规程

一个完整的基因芯片实验包括以下几个步骤：研究课题的提出、芯片设计、样品制备、杂交反应、数据分析和处理。本文主要介绍其中的样品制备(细胞标本采集和组织标本采集)的建议做法。

细胞标本采集操作建议规程

1. 所有样品均应有样品标签(注明样品编号)，同时有一张样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等。

2. 一张芯片实验一般要求细胞数在1E+08，建议设计实验和收获细胞时可考虑多收集一些。

3. 贴壁与悬浮细胞培养诱导结束后，去除培养液，保留的细胞用PBS缓冲液洗一下，除去缓冲液，加溶液D*充分溶解细胞，放入液氮运输。样品量以实际得到的total RNA为准。

4. 血液：将白细胞分离出来，加溶液D充分溶解细胞，放入液氮运输。样品量以实际得到的total RNA为准。

5. 如果是细胞未经溶液D处理，直接冻入液氮罐(不)。工作人员会对细胞作相关处理，以便为细胞记数。

6. 以上提到的均是新鲜细胞，对一些已老化或质量不明的细胞，工作人员有权提出疑义，并要求退回或重新取样。

不同组织抽提3-10μg mRNA所需组织量

器官/组织*     提取3μgmRNA所需组织量(克)     提取10μgmRNA所需织量(克)     总RNA得率[单位:毫克RNA/克组织]     mRNA所占百分比[%]
成人正常组织     肝     0.2083     0.6944     1.80 - 1.80 mg/g     0.80
成人正常组织     脑     缺数据     缺数据     1.30 - 1.30 mg/g     缺数据
成人正常组织     肺     0.3000     1.0000     1.00 - 1.00 mg/g     1.00
成人正常组织     心     0.5000     1.6667     0.60 - 0.60 mg/g     1.00
成人正常组织     胃     0.1852     0.6173     2.70 - 2.70 mg/g     0.60
成人正常组织     喉     0.3125     1.0417     1.20 - 1.20 mg/g     0.80
病理组织     结肠癌     0.2521     0.8403     1.70 - 1.70 mg/g     0.70
病理组织     胃癌     0.4317     1.4388     0.50 - 0.50 mg/g     1.39
病理组织     空肠腺癌     0.3571     1.1905     1.40 - 1.40 mg/g     0.60
病理组织     直肠癌     0.1604     0.5348     1.70 - 1.70 mg/g     1.10
病理组织     肝癌     0.1116     0.3720     3.84 - 3.84 mg/g     0.70
病理组织     肺癌     0.1282     0.4274     2.00 - 2.00 mg/g     1.17
考虑到个体差异以及样品在研磨、匀浆等过程中的损失，客户提供的样品量应在上述基础上增加1-2倍。

组织标本采集操作建议规程

铝箔     经DEPC水浸泡过夜，78°C烘干，高压灭菌后烘干
1.5 ml 微离心管
15 ml 聚丙烯离心管     市场有售RNAase-Free的相应规格离心管
标签纸    
记号笔    
样品登记表     由客户专人填写
液氮罐     应常备液氮罐，并保证液氮的来源
取材部位的病理切片     由客户提供1-2张
注：

· 以下步骤1 - 5应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的RNA降解。

· 对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。

1. 离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜;肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净(正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净)。

2. 在RNase-Free 0.9%生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。

3. 用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织(但统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。

4. 填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等 。

5. 将液氮冷却的组织放入样品袋(每个样品袋只保存同样的组织)，袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸(标签上注明：样品名称、编号、日期)，迅速转入便携式液氮罐。

6. 保留1-2张取材部位的病理切片。

基因芯片样品的制备要点：

1.目的DNA的选择对于大规模地研究基因表达问题，需要分析每一个基因的表达。因此，选择的目的DNA必须能够代表要研究的各个基因。对于整个基因组序列全部已知的生物，zui直接的方法是用PCR扩增基因组中每个已知的或预测的开放阅读框架(openreadingframe)，亦可以选择自己感兴趣的部分序列。对于没有测序，或只有部分测序的基因组，或者对于那些有大量内含子的基因组，上述方法就不现实。在这种情况下，我们首先考虑采用表达序列标记(EsT)。可以将单个EST的cD一NA克隆用作阵列DNA来源。对于还没有基因组测序计划或序列还未知的生物，可以利用cDNA文库作为DNA来源。当然这种文库是经归整化处理过，以减少不必要的冗余。

用作阵列的DNA可以是双链的，亦可以是单链的。但是其长度是小于开放阅读框架，或小于1000bp的cDNA。这对于很多具有同源性的基因尤为重要。当基因之间具有很高同源性时，选择基因之间有差异的部分，这样便可以提高基因之间的分辨度。所以，在考虑每个基因代表性的同时，应充分考虑所研究问题的具体情况。

2.pcR扩增一般而言，100uLIPCR反应体系得到的产物足以点印：000个基因芯片。PcR通常是在96孔PCR仪上进行扩增。实际扩增的反应条件要根据所用的模板及引物来确定。但要尽量减少PCR反应体系中的组分，尽量只用模板、引物、核昔酸、Mg标准缓冲液和酶。不要用甘油或明胶，它们往往会粘附在阵列块上而影响以后的点样工作。

3.点样前DNA准备点样以前，要将pcR产物清洗纯化干净，并且对DNA进行一些处理，一般用异丙醇沉淀PCR产物，以除去酶、离子及核昔酸等。沉淀后用70%乙醇院1次，再用95%乙醇洗1次，待*干燥后，将所沉淀DNA重溶在3xSSC中，其浓度掌握在100ny…左右、由于处理的样本量很大，一般直接在96孔板上直接操作，可选用能够配置96孔板的离心机(如SavantSpeedVacPlussC210A)。当把DNA溶于10～15tL13XSSC(pH7.0)中后，置于4”C至少12h。然后，将DNA溶液封存在一20C～4”C。

除极个别特殊的样品外，大多数的生物样品不能与基因芯片反应。对此，应该对样品进行提取扩增获取其中的目的蛋白质或基因，然后标记，可提高检测的灵敏度和实验操作人员的安全性。