层析柱规格 & @- q1 P( c' }* d			凝胶的规格和用量（ g ）
直径（ cm）	高（ cm）	容量（ ml ） & L) Q+ ^/ `" i	G25 1 g. l% A5 @& s4 m" _0 ^* C	G50 , k3 L) X! ?% Y- _. ?* A; f	G100 0 K" k" G" q. ?: W+ ~ n	G200
0.9	15 ; N7 d) E3 u$ \|8 t, d6 b$ R( x7 H8 {	9.5	2.5	1	0.6 ( c, i" m, x; i2 p$ I# C3 B	0.3
0.9	30 / p5 J5 L+ x, [& r+ A! R" T	19 " M! z+ a* E' R0 Q6 b5 j	5 $	2	1.2	0.6 '
0.9	60 2 e$ x7 x+ H: s, {	38 . U: R7 D- Q8 _	10	4 $ V/ ?- `1 G" \|( F, \|	2.5	1.2
1.6 $ \6 T# E! b5 r. J6 ^9 y" n	20	40	10 . Y8 s- V7 V) N/ d	4 7 @) o3 u$ u" g$ y	2.5 + v, _1 z( R# {, V& Y) Y, N# j7 ~	1.2
1.6	40 2 v2 G' J+ w$ {- O	80	20	8 9 X. k" q' }, L4 e; ?* n0 {	5.0 ( O# B$ D/ }2 F6 \) U! @	2.4 7 Q! `# r/ Q) _7 H# \
1.6	70		35	14	9.0 . m# H$ W4 D0 i7 \|	4.4
1.6	100	200 2 H. \|- [% W5 S9 `& ]	50	20	12.5	6 ( O3 w. n+ J; y
2.6 : T- v; ^) }- f& x	40 2 Y# P! C2 u0 T. b2 ]4 V	210	50	20 1 X7 P" u7 K) Q4 y( R5 c7 ~	12 - ]% Q4 J2 {4 o) ?, C, r$ @	7 1 ~7 y$ p( T; r. ]: C
2.6	70 % c6 E: \|$ H2 ~ ^7 M. f	370 $ s4 u s. f% b1 {0 z8 x	90 y9 f2 k% j& e5 u	35	20	12 8 Y. I: U& Y! _+ m( a7 C+ W
2.6	100 9 a1 X/ v7 o! ]$ j9 Z: l	530 $ Q c8 y1 o' W& g9 Y( s	130 k8 i1 ]5 F: t0 g0 t) A	50 ! D$ q$ f" Q# T: x	30 1 D/ {; c7 k8 ?/ }# ^	17 . l! O6 G0 f, f# U8 k7 `
2.6 $ ]7 o8 l' f- j; ^! W4 r4 z \|	60 1 G6 y* w4 H) x n	1000	250 6 I, V$ G3 m1 \|6 \|' ]	110 1 l0 y& \# `; @2 X	70 ) r2 W; A2 o3 W! [( ]* D: y J) o; [	35

为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。

3.装柱

层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应"，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1:5～1:25；对于纯化蛋白质来说应为1:20～1:100。

4.加样与洗脱

样品体积不宜过多，为床体积的1%～5%，zui多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。

洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/LpH6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/LNaCl）和0.1Mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/LNaCl）。

5.洗脱液收集

利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。

6.凝胶柱的重复使用与保存

当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：

（1）在液相中保存zui方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（如0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。

（2）用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。

（3）不用者，以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，zui后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。

凝胶过滤实验方法

收藏该商铺

提示

凝胶过滤实验方法

会员登录

收藏该商铺

提示