士锋基因定位克隆

习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便属于同一克隆。细胞学上，克隆是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，把将外源DNA插入具有自主复制能力的载体DNA中，使之得以自主复制和*保存的过程叫做分子克隆。

基因定位克隆或图位克隆（map-based cloning）是用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效的方法。具体的步骤是先将目的基因，亦即目的基因的突变定位到染色体上，并在目的基因的两侧确定一对紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记；接着利用zui紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因的特定的基因组片段克隆并分离出来；zui后是根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆中鉴定出目的基因。成功地应用基因定位克隆技术分离目的基因的一个必要条件是，以酵母人工染色体YAC（yeast artificial chromosome）为载体构建含有大片段DNA的YAC库。另一个必要的条件是要有可用的同目的的基因紧密连锁的DNA探针。

酵母人工染色体（yeast artificial chromosome。YAC）载体可以克隆数百kb的大分子量的dna片段。YAC载体包括如下的组成部分：
① 一段来自酵母染色体的着丝粒序列；
② 一段控制酵母DNA复制的自主复制序列（autonomously replicatimg sequence，ARS）；
③一对酵母的端粒序列，在有的YAC载体中（例如pYAC4），这对端粒序列来自四膜（Tetrahymena）染色体；
④选择记号；
⑤克隆位点。
YAC载体能够如同染色体一样在酵母细胞中正常地复制，并可以克隆大片段的外DNA，其大小至少可相当于zui大的酵母染色体。应用酵母人工染色体构建真核基因组YAC库的基本过程如下：首先选用核酸内切限制酶EcoRI和BamHI对YAC载体pYAC4作双酶消化，结果两个端粒序列之间的片段便被移走，产生出具有EcoRI粘性末端的两条臂分子。在每一条臂分子中都带有一段端粒序列和一个选择记号。同时再选用一种切割位点的核酸内切限制酶，对高分子量的真核基因组DNA作局部消化。

反应物通过脉冲电场凝胶电泳或密度离心除去分子量小于200kb的DNA片段，收集剩余部分的大分子量的DNA片段，纯化后与YAC臂连接。或者是直接从电泳胶中切出含有所需分子量范围的DNA片段的胶块，从中提取DNA，并与YAC臂连接。然后再经过一次脉冲电场凝胶电泳，把含有插入序列的YAC载体分离出来，并转化给已经去掉了细胞壁的酵母细胞，即原生质球。应用存在于两臂分子上的选择基因（selectable genes），筛选含有YAC两臂的酵母克隆。

一、RFLP分子标记

所谓RFLP，即DNA限制片段长度多态性，它是指应用特定的核酸内切限制酶切割有关的DNA分子，所产生出来的DNA片段在长度上的简单变化。由于核酸内切限制酶是以一种序列特异的方式切割DNA分子，来自一个完整的纯合子个体（所有的基因及DNA序列）的每一种同源的DNA分子，都会在同样的位点被准确地切割。

从不同的生态型（ecotype）或不同的地理隔离群（geographical isolate）植株分离的总DNA中，同源DNA分子通常会表现出序列的趋异性（divergence），形成RFLP。这些RFLP是由于DNA序列上的特定变化（突变）引起的，因此它们也能够像其他任何遗传标记一样进行定位，成为一种十分有用的分子标记。

RFLP作图的原理与步骤以拟南芥菜为例，简述RFLP作图的基本原理与步骤。将实验的条件限定为：两个不同的拟南芥菜生态型，即Columbia生态型和Niederzenz生态型；两个杂交探针，即基因A和基因B；一种核酸内切限制酶EcoRI。从这两个不同生态型的拟南芥菜提取的两份总DNA，经过EcoRI限制酶的切割和琼脂糖凝胶电泳分部分离之后，作Southern转移，并分别同放射性标记的探针基因A和基因B杂交。

在图中可以看到，两亲本生态型的DNA，同两种探针杂交的结果都呈现出多态性现象，这说明在这两个生态型的不同大小的DNA限制片段上，都存在着基因A和基因B的序列。F1代是杂合子，正如我们预期的情况一样，它含有两亲本的限制片段。由这些F1代植株自花授粉所产生的F2代植株中，也会出现这种预期的1：2：1的分离模式。这两个基因是独立分配还是连锁分配，会表现出非常不同的结果。

目前还可用其他分子标记如SSLP和CAPS等进行分子作图。

二、染色体步移

染色体步移的起点是具有一个与待分离的目的基因尽可能靠近的已经鉴定的分子标记。这种标记可以是RFLP，也可以是已知的基因克隆。

先构建起点RFLP标记克隆的限制图，并把其中zui靠近目的基因的限制片段亚克隆出来。此限制片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针，从基因组文库中筛选与起点克隆具有重叠序列的新克隆（称之为一步克隆）。重复进行上述的各个步骤。构建一步克隆的限制图，亚克隆其中zui靠近目的基因的限制片段，该片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针从基因组文库中筛选与一步克隆具有重复序列的新克隆（称之为二步克隆）。如此重复进行多次，每得到一个新的克隆都更接近目的基因一步，直至zui后获得了目的基因的克隆。由于这种技术是通过逐一克隆来自染色体基因组DNA的彼此重叠的序列，而慢慢靠近目的基因，因此