士锋分离纯化DNA片段中的污染物方法和原理

胶回收dna片段

一、 实验目的

1、 了解分离纯化DNA片段中的污染物方法和原理

二、 实验原理

首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下、专一地吸附DNA、RNA的原理(在高盐、低pH值情况下吸附DNA;低盐、高pH值情况下释放DNA。离心柱上含有Resin合成树脂，具有吸附DNA的功能)，配备设计*的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以回收核酸片段。

三、 仪器与试剂

实验仪器

1、琼脂糖凝胶电泳系统

2、紫外观察分析仪

3、离心机

4、单面刀片

5、恒温水浴锅

试剂

1、 DNA回收试剂盒

溶胶液：6 M NaClO 4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC(pH 5.2)溴酚红少许

洗液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0) 70%乙醇

存储液：TE buffer (10 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0).

2、50×TAE(洗液：50 mM Tris-Hcl，0.1 mM EDTA，pH 8.0) 70%乙醇

)

3、ddH2O(重蒸水，蒸馏两次的水)

四、实验步骤

1)在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖.放入1.5ml离心管中。

(切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。)

(紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。)

2)按每100mg琼脂糖加入300—600μl溶胶液的比例加入溶胶液(本实验加500ul)，置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块*溶化，期间每2分钟颠倒混匀一次促溶。

(利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未*溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解;胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收;电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合 DNA，如pH太高，应作适当调整;漂洗液中未加入无水乙醇。)

3)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体.再将吸附柱放入同一个收集管中。

4)在吸附柱中加入500ul漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

5)再在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

6) 12000rpm 室温空离心1分钟。

(可以改用去离子水洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH 值，以增加洗脱得率。

洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保*去除漂洗缓冲液)

7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟(为提高回收效率可再洗脱一次)，将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。

8)琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。

(不可以使用更小洗脱体积(小于说明书提供的zui小洗脱体积)进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的zui少洗脱体积是能*覆盖吸附膜的zui小体积，若减少体积则不能将DNA*洗脱下来。

电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。

琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好;含目的片段的凝胶再空气中放置过久， 使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃;制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。)

五、注意事项：

§ 切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛;

§ 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。

§ 胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。

§ 把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率。

& 提高胶回收量的办法：

1) 增加电泳时的上样量。

2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。

3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要了，不然影响回收率。

4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。

5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多于750ul。

6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0，3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子更好 的拦截在膜上，可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。

7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟)，以使乙醇充分挥发。

8)zui后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱(不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱);洗脱液滴在膜，以充分洗脱结合在 膜上的DNA。

9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。

10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。