DNA的重组

DNA的重组

(一)DNA的酶切与连接

(1)酶切反应

同质粒dna的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。

(2)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。

(3)15000rpm离心15min，弃上清。

(4)加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。

(5)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。

(6)测定DNA的含量。

(7)加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入dna片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。

(8)连接反应液可置-20℃保存，供转化用。

(9)关于待插入DNA片段的获得参见附注。

(二)大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

1.感受态的制备

(1)接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。

(2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。

(3)倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。

(4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。

(5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

2.重组DNA的转化

(1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：

转化项目     受体菌     DNA     总体积
DNA对照组     0     10μl     200μl
受体菌对照组     200μl     0     200μl
转化组     190μl     10μl     200μl
(2)冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。

(3)42℃90s。

(4)37℃水浴5min。

(5)加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。

(6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。

(三)转化子DNA的快速鉴定-快速细胞破碎法

(1)挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。

(2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。

(3)加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min以上。

(4)15000rpm离心15min。

(5)吸取上清点样电泳，观察。

(四)转化子DNA的酶切鉴定

1.转化子DNA的快速少量抽提

(1)同本节 二.(三).1.

(2)菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,离心9min，去上清。

(3)加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴10min。

(4)15000rpm离心15min。

(5)吸取上清，加入异丙醇1ml混匀，置室温15～30min。

(6)15000rpm离心15min，弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

(7)离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解DNA。

(8)取少量DNA电泳，观察浓度。

2.转化子DNA的小量酶切鉴定 同质粒DNA的小量酶切鉴定，见本节 一(三)。

(五)重组子DNA的进一步鉴定

可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定，详见本节 四。

[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段

(1)用合适的酶切割DNA并电泳。

(2)于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。

(3)将透析袋(纵长)与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。

(4)取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。

(5)吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。

(6)加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。

(7)于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。

(8)用75%的酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。

(9)真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。