小白鼠染色体的制备和观察

一、实验目的 
通过实验，掌握空气干燥法制片技术。 
二、实验原理 
在骨髓细胞中，有丝分裂的指数是相当高的，因此可以直接得到中期细胞而不必像血淋巴细胞那样要经过体外培养。通过骨髓得到染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。在临床上多用于白血病的研究，在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，而且用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。 
直接制片法，是直接从骨髓中取出细胞，经压片法或空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素处理 ─ 低渗处理 ─ 充分的固定─ 滴片等步骤之后在载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载片在室温下自然干燥的方法。空气干燥法是一个十分有用的基本技术，要熟练掌握。 
三、实验材料 
小白鼠 
四、实验器具和药品试剂 
冰箱、离心机、恒温水浴锅、显微镜、分析天平、药物天平、试管架、离心管、吸管、烧杯、量筒、注射器(1ml、5ml)、5号针头、载玻片、解剖盘、解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、切片盒、切片架、纱布。 
秋水仙素、柠檬酸钠、氯化钾、冰醋酸、甲醇、磷酸缓冲液、Giemsa、甘油、 
硫酸、重铬酸钾。 
五、实验方法和步骤 
(一) 秋水仙素处理 取骨髓前3～4小时先给小白鼠经腹腔注入0. 1％的 
秋水仙素，注射剂量为4毫克／每公斤动物体重。 
(二) 取骨髓 经秋水仙素处理的小白鼠，可用损伤脊髓法处死，然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出大腿骨和胫骨，用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨两端膨大的关节头，然后将股骨剪碎投入小烧杯中，用2毫升1％柠檬酸钠溶液搅烂碎骨，使骨髓细胞游离出来。静止片刻，用吸管把悬浮液吸到离心管中，可重复冲洗一次。此时离心管中的细胞悬浮液可达 4～5毫升。 
(三) 低渗 将所获得的细胞悬浮液行平衡(注意：每次离心前都要平衡)，然后以 1000rpm离心10分钟，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，加0.075M KCL 溶液至8 毫升刻度，将细胞沉淀物吹散打匀，在水浴37℃ 低渗20～30分钟。 
(四) 固定 低渗处理后的材料，以1000rpm离心10分钟，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，用吸管吹散沉淀物，沿管壁加固定液至6毫升, 冲匀后静止固定20分钟，即*次固定。按上述条件离心，去上清液，再次加入固定液至6ml，进行第二次固定。20分钟后离心吸去上清液，留0.2ml沉淀物,再往沉淀物中滴加4滴固定液，冲匀制成细胞悬液。 
(五) 滴片 取事先在冰箱中预冷的载玻片(载玻片须经硫酸洗液浸泡10天以上，经清水冲洗，用蒸馏水浸泡)，滴2～3滴细胞悬液于粘有冰水的载玻片上，用嘴吹气，使细胞迅速分散。将载片插放在切片架上晾干。 
(六) 染色 取2张制片平放在玻璃板上，用10：1 Giemsa染液染色20分钟，流水冲洗后晾干即可镜检。 
(七) 观察 用中倍镜选择分散适度，不重迭的染色体分裂相，转高倍镜详细观察小白鼠染色体的形态特征，并计算2n的染色体数目。