植物微核检测实验

一、实验目的
1．了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活与工作中的应用范围及意义
2．学习蚕豆根尖的微核测试技术
二、实验原理
微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核1／3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。且有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率可达99%以上。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。
三、实验材料
松滋青皮豆（蚕豆）种子
四、实验器具和药品
实验器具：显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、滤纸
实验药品：氯化鈷
五、实验过程
1．实验材料的培育
蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高．因而对诱变因子反应敏感。松滋青皮豆是从不同蚕豆品种中筛选出来的一种较为敏感的品种。本品种引入后在栽培繁殖时要注意不要同其它蚕豆品种种在一起，不喷洒、以保持该品种较低的本底微核值。也可用其它蚕豆品种，但是必须设置对照组。种子成熟后，晒干贮藏于干燥器内或4℃冰箱内备用。
2．浸种催芽：将实验用蚕豆种子按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯中，在25℃下浸泡24小时，此间至少换水两次．所换水应25℃预温。种子吸胀后；用纱布松散包裹置白磁盘中，保持湿度，在25℃温箱中催芽12－24小时，待初生根长出2—3mm时，再取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的磁盘中，25℃继续催芽，经约36～48小时．大部分初生根长至1～2cm左右，根毛发育良好，这时即可用来进行检测了。
3． 处理
用被检测液处理根尖，每一处理选取6－8粒初生根尖生长良好、根长一致的种子，放入盛有被检测液的培养皿中，被检测液浸泡根尖。同时，取另一培养皿以蒸馏水处理根尖，作为对照。
处理时间约为6小时（此时间可根据实验要求和被检测液的浓度等情况而定）。
4．根尖细胞恢复培养
将处理后的种子用蒸馏水浸洗三次，每次2－3min。将洗净的种子再放入铺好滤纸或脱脂棉的白磁盘内25℃温箱中恢复培养22－24小时。
5．固定根尖细胞
将恢复后的种子从根尖顶端切下1cm长的幼根放入广口瓶中，以卡纳氏固定液进行固定2-24小时后，保存于70%乙醇溶液中。
6．镜检及微核识别标准
常规制片后，将玻片标本放在显微镜的低倍镜下观察，找到分生组织区细胞分散良好、核膨大、分裂相多的部分转到高倍镜下进行观察。
微核识别标准：
（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。
（2）小核着色与主核相当或稍浅。
（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。
每一处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数并进行记录。