PCR检测细胞支原体污染

支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 支原体,M.FermentaneATCC19989发酵支原体 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原体 ,M.HominisATCC23114人型支原体 ,M.OraleATCC23714口腔支原体 ,M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体。其共同引物序列来自16s和23s保守区域，外部引物为F1 5′-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3′，R1 5′-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3′;内部引物为 F2 5′-GTTCTTTGAAAACTGAAT-3′，R2 5′-GCATCCACCAAAAACTCT-3′。

PCR反应体系和条件：10×缓冲液(10mMTris-HCl、500mMKCl、20mMMgCl2、0.01%明胶)、primerF1、R1、F2、R2的浓度为2nmol/μL、2.5mMd NTPs、Taq酶、H2O、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2min预变性、94℃/30s变性、55℃/1min退火、72℃/1min延伸,循环30次后72℃延伸5min。第1次PCR反应取模板10μL,第2次PCR反应以第1次PCR扩增产物为模板取1μL。

下面有更详细的：

污染测试--支原体 : PCR方法

原理：

利用具特殊专一性之primers，经由pcr反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。

特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。

缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。

材料与设备：

ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.

提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture

positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)

PCR reagents :

Taq polymerase ( 5 U / ul )

dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )

10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)

25mM MgCl2

sterile ddH2O

Machine / Equipment：

PCR thermal cycler

agarose电泳设备

DNA电泳胶体观察设备

无菌PCR反应管

无菌1.5 ml微量离心管

无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans

方法：

此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。

结果：使用UV light观察，并照相记录。

不过应用较多还是巢式PCR

方法：

此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。

结果：使用UV light观察，并照相记录。

方法再详尽点:

3.1 1st stage PCR reaction(total volume 25 ul)：

3.1.1 测试样品 ( 2 ul / each )

3.1.1.1 直接取样测试细胞之培养液。

3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )

3.1.1.3 Negative control : ddH2O

3.1.2 Reaction mixture ( 23 ul / each )

3.1.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul

3.1.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l

3.1.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

3.1.2.5 Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul

3.1.2.6 ddH2O 18.4 ul

3.1.3 PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler

3.1.3.1 step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

3.1.3.2 step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

3.1.3.3 step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min

3.1.3.4 step 4 : extension: 72 ℃ 2 min

3.1.3.5 重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles

3.1.3.6 step 5 : final extension 72 ℃ 5 min

3.2 2 nd stage PCR reaction(total volume 25 ul)

3.2.1 测试样品：1st stage PCR product(1 ul / each)。

3.2.2 Reaction mixture ( 24 ul / each )

3.3.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

3.3.2.2 2 nd stage primer mixture 0.5 ul

3.3.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul

3.3.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

3.3.2.5 Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul

3.3.2.6 ddH2O 19.4 ul

3.2.3 PCR program同3.1.3;使用PCR thermal cycler

4.0 胶片电泳分析

4.1 胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。

4.2 电泳液：(1x) TAE buffer(Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer)

4.3 选择100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )

4.4 取10 ul 2 nd stage PCR产物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。

4.5 进行电泳分离100V, 25 min。

4.6 胶片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。(EtBr为致癌物质，请戴手套并小心操作)

4.7 结果：使用UV light观察，并照相记录。

Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit)

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