PCR引物设计的原则

pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 
让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 

同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记、荧光素、地高等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则： 

① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 
② 产物不能形成二级结构。 
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 
④ G+C含量在40%~60%之间。 
⑤ 碱基要随机分布。 
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 
⑧ 引物5′端可以修饰。 
⑨ 引物3′端不可修饰。 
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。 

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 

1.引物的特异性 

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 

2.避开产物的二级结构区 

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 

3.长度 

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，zui适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的zui适温度（74℃),不能保证产物的特异性