PCR技术的应用与微生物系统进化研究的发展

分类和进化研究是生物学中zui古老的领域之一。过去的研究主要依靠生物体的形态，并辅以生理特征，来探讨生物间亲缘关系的远近，有人称之为经典的方法，它是一百多年来完成微生物分类的主要方法。经典的方法是随机的和不系统的，只适用于一些形态复杂的真核生物和较大的原核生物。现在，由于生物技术的不断完善，人类对自然界的认识水平不断地提高，就对以前的一些研究方法以及研究结果提出了质疑。如以来，生物界被划分为原核、真核两大界，认为真核生物由原始的原核生物进化而来。但随着对原核生物各类群的研究的深入，却发现许多生活在环境(高盐、高温、pH值)的古细菌(Archaebacteria)在生理生化诸多方面与一般的真细菌存在巨大差异，其分子机制亦相当*。那么，这类古细菌是否应当从原核生物中独立出来而自成一个体系呢？近年来，由于分子生物学的迅速发展和广泛应用，特别是蛋白质和核酸序列研究的突破性进展，使微生物系统分类的基础发生了重大的变化，分类系统已经或正在随着分子标准的不断渗入而完善。所谓分子标准主要是指建立在DNA分析技术基础上的分类方法。与表型特征相比较，核酸序列在生物体的进化过程中较少受到环境的影响，因而更能反映出生物体在演变进化过程中的本质，其研究结论也更可靠。这样，人们就将系统进化研究从宏观逐渐转向微观，并把宏观和微观的特征结合起来，以便更准确地反映生物体间真正的进化关系。

早期的分子标准主要建立在诸如DNA碱基比例测定或核酸分子杂交等基础上。我们知道，每一种生物体均有其*的、稳定的核酸成分和结构；不同生物间核酸成分和结构的差异程度代表着它们之间亲缘关系的远近。由此，从核酸分子水平来研究生物的进化关系就成为分类学的一个新途径，微生物分类学也不例外。zui早在1956年由Lee等提出了DNA碱基比例的测定方法。DNA碱基比例主要是指“G+Cmol％”比例，即(G)和胞嘧啶(C)在整个DNA中的摩尔百分比。不同种的微生物，其4种碱基的含量及排列顺序不同，因此G+Cmol％比例一般会随种的不同而有变化。一般来说，G+Cmol％差异愈大，分类地位愈疏远。而G+Cmol％比例相似，可能属于同种，也可能不是同种，因为碱基成分相似的DNA可能有很多种碱基顺序。例如，螺菌属(Spirillum)的G+Cmol％比例是38％～65％，辐度过宽。后来根据其碱基成分和其他特征的不同已被划分成3属：螺菌属(Spirillum，38％)、海洋螺菌属(Oceanspirillum，42％～48％)和水生螺菌属(Aquaspirillum，50％～56％)。
如前所述，测定DNA的G+Cmol％比例只能确定含量不同的细菌为不同的种，而不能确定含量相近的细菌必然属于同一个种。若要进一步确定，还必须借助其他方法，例如核酸分子杂交方法。研究DNA-DNA或DNA-RNA杂交zui方便的方法，就是采用来自一个菌株的放射性核酸与来自另一个菌珠的非放射性核酸，经热变性之后，把两种核酸样品混合，使其复性，测定放射性结合键的百分率。百分率越高，说明两者碱基顺序的同源性越高，亦即亲缘关系越近。核酸分子杂交技术对解决种水平上的分类学问题和确定新种是十分有效的。

从20世纪70年代初起，16S rRNA序列分析成为细菌分类的一个重要指标。16SrRNA分子具高度的保守性，在30多亿年的进化中仍保持着原初的状态，因此可用作探索自古至今生物的主要进化历程，是一种理想的研究材料。1977年，Woese等人测定了200多种原核生物的16SrRNA和真核生物的18SrRNA的寡核苷酸顺序谱，经比较研究，不但搞清了原核生物和真核生物的许多系统进化问题，而且还以此为根据提出了生命体系的三界学说，引起了生物学家的普遍关注，并由此而引发了研究古细菌的热潮。16SrRNA寡核苷酸顺序分析所依据的基本原理是这样的，用可专一性地水解G()上3′端磷酸酯键的核糖核酸酶水解提纯的rRNA，产生一系列以G为结尾的长度不一的寡核苷酸片段，一一测定其核苷酸序列，zui后把它们编成一部“词典”。两个菌株rRNA的相似性就可通过查阅“词典”来作比较。但这种方法在当时是一项工作量大，实验条件复杂和操作要求十分严格的分析技术，因此其应用仍然受一定的限制。

80年代中期，聚合酶链反应(PCR)的出现和完善，以及利用PCR扩增产物进行碱基序列分析方法的出现，使迅速得到特定DNA段的遗传信息成为现实，这样就使得人们可以用完整而不是部分的DNA序列来判断生物之间的系统发育关系。1996年8月，《science》发表了美国TICR(The Institute for Genomic Research)研究所的学术成果──产甲烷球菌的全基因组序列。这是自Woese提出三界学说以来测定的*个古核生物(Archaea)的全基因组序列，从而为古核生物的研究提供了充分的序列材料。TIGR给出了产甲烷球菌的1738个基因的定位，经同源性搜索和GENEMARK的基因定位方法研究，结果表明，约有58％的基因在现有生物的基因数据库中找不到同源序列。这足以说明产甲烷球菌上有着大量的新基因序列，从而为三界学说的建立和发展找到了坚实的证据。