RNA琼脂糖凝胶电泳实验操作步骤与注意事项

 1%的RNA琼脂糖凝胶电泳可以用来检测RNA的完整性，本实验的主要目的是熟悉植物总RNA非变性胶电泳操作原理和操作方法与步骤。

一、实验目的

掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。

二、实验原理

RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在*变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。

三、实验材料、器具及药品

蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。

四、实验步骤

（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

RNA的变性琼脂糖凝胶检测

试剂：

（1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS） （Ph7.0），0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。

（2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。

（3）甲醛。

（4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。

操作：

（1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。

（2） 配制琼脂糖凝胶。

①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖*溶化均匀。

②待胶凉至60--70 ℃，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。

③灌制琼脂糖凝胶。

（3） 样品准备：

① 取 DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品 4.5ul,混匀。

② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。

③ 向管中加入3ul 上样染料，混匀。

（4）上样。

（5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。

（6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。

小结：RNA琼脂糖凝胶电泳中务必去除RNASE酶的污染，所有的试剂需用DEPC水配制，所用的器材也要的DEPC处理并灭菌，防止RNA被降解。