猪伪狂犬病毒gE 蛋白抗体检测试剂盒

                    （中文说明书仅为参考，以英文说明书为准）

简介

    伪狂犬病毒 （PRV ）又称Aujeszky’s 病毒，它属于α-疱疹病毒，可导致猪群广泛感染，在养猪业具有重要经济意义。它能引起广泛的临床症状包括神经系统紊乱、呼吸性疾病、繁 殖障碍和死亡。许多国家已经开始了*伪狂犬病的计划。PrioCHECKPRV-gE 2.0 检测猪 血清中的PRV gE 蛋白抗体，不受PRV gE 缺失疫苗免疫猪的抗体滴度影响。gE 蛋白抗体阳性表明已用含gE 抗原的疫苗免疫和/或感染不同型的PRV 野毒。 PrioCHECKPRV-gE2.0能够区分用gE基因缺失苗免疫的感染猪和免疫猪群。 PrioCHECKPRV-gE 2.0 可用于猪的血清流行病学研究，用来检测测免疫猪群和感染猪群。

PrioCHECKPRV-gE 2.0 ELISA 和gE 缺失苗的使用是伪狂犬免疫-*联合计划的基础。除

此之外，本试剂盒还可从未免疫猪群中检测出感染猪。

检测原理

    本试剂盒的原理是阻断ELISA，用于检测伪狂犬病毒gE蛋白抗体。PRV gE蛋白和特异 单抗（mAb）间的反应被待测样品中存在的特异性抗体阻断。

用非感染性的PRV抗原包被酶标板。每孔加入等体积未稀释的猪血清和ELISA缓冲液

 （血清zui终稀释度为1：2）酶标板在37±1℃孵育1 h或5±3℃放置过夜。洗板后加入酶标 单抗，37±1℃再次孵板1h。再次洗涤后加入显色剂/底物溶液。20min后加入终止液终止显色反应并测定OD450nm 。

    试剂盒还有1份直接使用的弱阳性质控样品，它的用途是：

    -  使客户能分析PrioCHECKPRV-gE 2.0 ELISA试剂盒的变化趋势

- 使客户能利用软件和OD650值相应地调整底物显色时间

试剂盒组成

-  成分1  酶标板5块

-  成分2  浓缩的酶标结合物 （30X）1瓶2.5ml稀释后的酶结合物不稳定，需现用现配。

-  成分3  浓缩稀释缓冲液（2X）1瓶 60ml配制好的溶液可以在22±3℃保存4小时

-  成分4  浓缩洗液（200X）1瓶 60ml，配制好的溶液可以在22±3℃保存1周

-  成分5阴性对照（直接使用）1瓶1.5ml（绿色）

-  成分6阳性对照（直接使用）1瓶1.5ml（红色）

-  成分7弱阳性对照 （直接使用）1瓶1.5ml（橙色）

-  成分8底物/显色剂溶液（直接使用）1瓶 60ml

-  成分9终止液（直接使用）1瓶 60ml

-  其它成分：

10个封板膜、分析报告（Certificateof Analysis）、说明书（Package Insert）

试剂盒未提供的其它材料：

常规化设施：

符合本国生物安全要求的实验室设施

结果分析用设备：

酶标仪，如Multiscan EX 或同类产品，需装配450nm 滤光片

可选设备：

洗板机，如Tacan EIV Tray Washer 或同类产品。

注意事项

应严格遵从本国的动物样本处理规定。PrioCHECK® PRV-gE 2.0 试剂盒应在有条件的实验室

应用。

应该把样品视为有潜在感染的物质，所有与样品接触的材料应该认为有潜在的污染性。

化学试剂的安全性说明见“Safety Regulations and R&S Statements”（Appendix II）

注意

   为了获得更佳的结果，需遵从下列因素：

   严格遵守检测程序

   所有试剂在使用前放置室温平衡。

   每次吸液更换移液头

   每种试剂分开保存。

   禁止使用过期试剂或性状改变明显的试剂

   不要混用不同批次试剂盒中的试剂

   试验需使用去离子水或相同质量的水

需预先配制的溶液

    试剂盒中的所有试剂使用前恢复至室温（22 ±3℃）。

1．ELISA 缓冲液：用去离子水或蒸馏水将浓缩稀释缓冲液 （成份3）稀释2 倍。浓缩稀释缓冲液提供量可以配制120ml 。配制好的溶液可以在22 ±3℃保存4 小时

2．酶标结合物：用ELISA  缓冲液新鲜配制酶标结合物工作液。1 块酶标板需要配制12ml（0.4 ml 酶标结合物浓缩液（30x）加入到11.6ml ELISA 缓冲液中）。

注意：酶标结合物液一定要现用现配）

3．洗液：用去离子水或蒸馏水将浓缩洗液稀释200 倍。浓缩洗液的量足够配制终体积为12L 的洗液。

   注意：可用商业化ELISA 洗板机洗涤。如无洗板机，每孔应至少加入200uL洗液。随后倾去酶标板中的液体，按上述方法重复的次数。不必浸泡酶标板。zui后一次冲洗后，用力拍干。

待测样品

    血清样品试验前可在4℃储存几天，也可在-20℃储存更长的时间。

检测步骤

    所有试剂和样品必须恢复至室温（22 ±3℃），使用前轻轻倒置混合。

1．孵育待检血清

1.1  每孔加入50ul ELISA 缓冲液。

1.2 向A1 和B1 孔中各加入50ul 阳性对照。（成分7）

1.3 向C1 和D1 孔中各加入50ul 阴性对照（成分5）。

1.4 向E1 和F1 孔中各加入50ul 弱阳性对照（成分6），此为可选步骤。

1.5  剩余每孔加入50ul 待测样品 （单孔或复孔）。

1.6  用封板膜封板

1.7  轻轻振荡酶标板。

1.8 37±1℃孵育60min±10 min  （相对湿度大于90%）或5±3℃放置过夜。

2．孵育酶标结合物

2.1 孵育结束后倾去酶标板中的液体，用洗液洗板6 次。zui后一次洗涤后用力拍干。

2.2 每孔加入100ul 酶标结合物工作液。

2.3 封板并轻轻振荡酶标板。

2.4 37±1℃孵育60min±20 min    （相对湿度大于90%）。

3．孵育显色剂/底物溶液

3.1 孵育结束后倾去酶标板中的液体，用200 至300ul 洗液洗板6 次。zui后一次洗涤后用力拍干。

3.2  每孔加入100ul 显色剂/底物溶液。

3.3 在22 ±3℃（孵育20min     （15-30 min）。

3.4 加入100ul 终止液。

3.5 混合酶标板孔中的内容物。

注意：从*孔加入显色剂/底物溶液开始，计时20min  后开始加终止液，加终止液的顺序和速度一定要和加底物相同。

4．读板并计算结果

4.1 终止显色反应后15min 内测出OD450nm 。

4.2 计算阴性对照的平均值（C1 和D1 孔），此为zui大OD450 zui大值）。

4.3 阳性对照、弱阳性对照和待检血清的阻断率按下式计算：

注意：

                              待检血清的OD450

PI =       100 － ----------------------------------------------- ×100

                              OD450 zui大值

5．有效性标准

基于OD450 的有效性确认：

5.1 阴性对照（C1 和D1 孔）的平均值（zui大OD450 值）必须在0.9 以上。

5.2 阳性对照的阻断率必须≥65%。

5.3 弱阳性对照的阻断率必须≥45％。

5.4 不符合上述标准的试验结果应舍弃。

基于OD650 的有效性确认

5.5 阴性对照（C1 和D1 孔）的平均值（zui大OD650 值）必须在0.4 以上。

5.6 弱阳性对照（E1 和F1 孔）OD650 值的必须>0.15。

5.7 弱阳性对照除以阴性对照的平均OD650 值的阻断率必须<0.6且>0.3。

5.8 不符合上述标准的试验结果应舍弃

注意：如果zui大OD450 平均值低于1.000，可能是因为显色剂/底物溶液的温度太低，此时应预热显色剂/底物溶液至22 ±3℃或延长孵育时间（zui多30min）。如果zui大OD450 平均值高于2.000 推荐缩短孵育时间。

如果样品值大于zui大OD450 平均值，抑制率可以被认为是0%。

6．结果判定

   PI＝＜35％              阴性               待测血清中不存在PRV-gE 特异性抗体

   PI＝≥35％              阳性               待测血清中存在PRV-gE 特异性抗体。