聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。ELISA试剂盒

1. 抗原及酶标记抗体

①抗原：兔抗人IgG（Rabbit Aanti-human IgG，Code No.A0423）;

②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP（Rabbit Anti-mouse IgG-HRP，Code No.P0260）;均为

DAKO 公司产品，使用时按照说明书要求稀释。

4. 洗涤液（含0.05%Tween 20的PBS）：1LPBS 中加入Tween-20 500μL。

5. 封闭液（含1%牛血清白蛋白，0.1%Tween 20的PBS）：10mLPBS 中加入100mgBSA，10μLTween-20。

6. 底物溶液

①*缓冲液（0.1mol/LpH6.0）：称Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O 6.84g，用蒸馏水溶解，定容至500mL。

② TMB 贮液：称60mgTMB 溶于10mL 二甲基亚砜中，4℃避光保存。ELISA试剂盒

③底物应用液：现用现配，磷酸钠缓冲液10mL，TNB 贮液10μL。30%H2O2 15μL，混匀。

7. 终止液：2mol/LH2SO4

①抗原包被：兔抗人IgG 作为抗原，用包被液l：8000稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板

②洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。

③封闭：加l00μL/孔封闭液，室温放置0.5h。

④洗涤：用洗涤液洗3次。

⑤加待测样品（一抗）：将含单克降抗体的细胞培养上清在另—块板上用PBS 连续稀释（按照1：2或1：10），100μL /孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，PBS 或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。加盖37℃恒温箱温育1~2h。ELISA试剂盒

⑥洗涤：用洗涤液洗3次。

⑦加酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP，用封闭液l ：8000稀释，100μL/孔，加盖37℃恒温箱温育1h。

⑧洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。

⑨显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5～30min，显示蓝色。

⑩终止反应、比色：加50μL/孔终止液.颜色变黄;用酶标仪测定450nm 处各孔的吸光值，阳性反应的zui大稀释度为待测样品的效价。