人Ⅱ型胶原 (COL-2)酶联免疫试剂盒使用说明

本试剂盒适用于以下样本的测试（黑底字体为适用样本）：

血清、血浆- 组织匀浆 –腹水 –细胞培养上清

本试剂盒仅供研究，不用于临床诊断

目录

1. 实验原理
2. 试剂盒组成
3. 试剂盒保存
4. 需要而未提供的试剂和器材
5. 试剂准备
6. 样本前处理
7. 洗板方法
8. 详细操作程序
9. 操作总结
10. 性能参数

1. 实验原理：本试剂盒采用竞争法法检测样本中Ⅱ型胶原 (COL-2) 的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入辣根过氧化物酶标记的识别抗原，在37℃下孵育1小时，两者与固相抗原竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤后，结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。

2.试剂盒组成：

备注：

• 试剂盒中“样品稀释液”为0.05M的PBS，“终止液”为2M的H2SO4，洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST，如不够可自行配制。

b.不同公司的缓冲体系存在较大差异，请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。

c.浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出，稍微加温后即会消失，不影响使用。

3.试剂盒保存

• 2-8℃下保存6个月，在-20℃下可以保存更长的时间。酶标板为真空包装，板条可以拆卸，拆开以后如一次不能用完，请放入提供的密封袋中，放入干燥剂，2-8℃保存，在一个月之内仍然有效。试剂不能反复冻融。

4．需要而未提供的试剂和器材

1. 37℃恒温箱。
2. 标准规格酶标仪。
3. 精密移液器及一次性吸头
4. 双蒸水或超纯水
5. 干净的试管或Eppendof管
6. 吸水纸
7. 自动洗板机或8道排枪
8. ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc
9. 500ml烧杯的和适当量程的量筒

5试剂准备

1. 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。
2. 本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。
3. 洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。
4. 标准品的稀释：取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上64ng/ml，32ng/ml，16ng/ml，8ng/ml，4ng/ml .取150μl标准品原液加入标记64ng/ml 的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至zui后一管。零孔：直接加标准品/样品稀释液。（见下图）

•     128ng/ml      64ng/ml，  32ng/ml，   16ng/ml，    8ng/ml，    4ng/ml

6样本前处理

a.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
b.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
c.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
d.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
e.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
f.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

1. 洗板方法

1. 手工洗板：先洗去酶标孔中的的液体，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液，轻轻摇晃30秒，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。
2. 洗板机洗板：洗板机洗板比较便捷，但应操作熟练后使用。
3. 详细操作程序

1. 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。
2. 空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。
3. 标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入酶标试剂50μl。
4. 样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入酶标试剂50μl。
5. 轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。
6. 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
7. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
8. 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
9. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
10. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
11. 计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线（四参数）。标曲示意图如下：

1. 操作总结

准备试剂，样品和标准品

加入准备好的样品和标准品，酶标试剂，37℃反应60分钟

洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10分钟

加入终止液

10分钟之内读OD值

计算

1. 性能参数

1. 批内差：CV＜10%
2. 批间差：CV＜12%
3. 灵敏度：0.4ng/ml
4. 保存：    2-8℃
5. 规格：    96T/盒
6. 有效期：  6个月（2-8℃）。
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