人乙型肝炎病毒 e 抗原（HBeAg）酶联免疫分析（ELISA）

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用       目的：本试剂盒用于检测人血清，血浆及相关 液体样本中乙型肝炎病毒 e 抗原（HBeAg）水平。

实验原理：

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA ）测定标本中人乙型肝炎病毒 e  抗原 （HBeAg）。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中乙型肝炎病毒 e 抗原（HBeAg） 相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与 HRP 标记的抗体结合，形成抗体-抗原

-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成zui终的黄色。用酶标仪在 450nm  波长下测定吸光度（OD  值），与 CUTOFF 值相比较，从而判定标本中人乙型肝炎病毒 e 抗原（HBeAg）的存在与否。

试剂盒组成：

样本处理及要求：

1.  血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.  血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心

20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次 离心。

3.  尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.  细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞 浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分

钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.  组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待 检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7.  不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：

1.    编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照 2 孔、阳性对照 2 孔、空白对照 1

孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2.    加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照 50µl。然后在待测样品孔先 加样品稀释液 40µl，然后再加待测样品 10µl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不 触及孔壁，轻轻晃动混匀，

3.    温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

4.    配液：将 30（48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至 600ml 后备用

5.    洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。

6.    加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。

7.    温育：操作同 3。

8.    洗涤：操作同 5。

9.    显色：每孔先加入显色剂 A 50µl，再加入显色剂 B 50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

15 分钟

10.  终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.  测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

结果判定：

试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00;  阴性对照平均值≤0.10

临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15

阴性判定：样品 OD 值< 临界值（CUT OFF）者为乙型肝炎病毒 e 抗原（HBeAg）阴性 阳性判定：样品 OD 值≥ 临界值（CUT OFF）者为乙型肝炎病毒 e 抗原（HBeAg）阳性

注意事项

1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。

2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。

3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物请避光保存。

6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为 630nm

7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为 2M 的硫酸，使用时必须注意安全。