利用合成的*抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,通过细胞融合技术和间接竞争ELISA筛选出了能分泌*单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以此为基础研制*残留检测的竞争ELISA试剂盒(competitive ELISA ENR-Kit),并测定其性能。结果表明:筛选出的2株杂交瘤细胞,单抗亚类均为IgG1型,其中4G1-B3株的ENR mAb间接ELISA效价为1:1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/mol;竞争ELISA试剂盒的线性检测范围为0.05~101.6μg/L、灵敏度0.05μg/L、半数抑制浓度(IC50)1.1μg/L,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均小于0.01%,鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率分别为81.5%8、7.6%、84.3%和95%,不同基质添加*标准品做竞争ELISA对ENR-Kit检测结果影响小,试剂盒保存期6个月以上。结果说明该竞争ELISA试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点,适用于ENR残留的快速检测。

ELISA测定亲和常数,其中4G1-B3株的亲和常数为9×1010L/mol,4G1-G1株的亲和常数为4·5×1010L/mol,结果见图1,依据抗体亲和力理论[13,14],亲和力较好。Ig亚类鉴定为IgG1亚型。选择亲和常数zui大的4G1-B3株制备的腹水研制竞争ELISA试剂盒。图1　*单抗的亲和常数测定曲线Fig.1　Association constant (Ka) curve of ENR mAb2·2　竞争试剂盒的性能参数2·2·1　ENR mAb与HRP-ENR工作浓度　方阵滴定结果显示,ENR mAb的*工作浓度为1∶128000;HRP-ENR的*工作浓度为1∶1000。2·2·2　灵敏度和标准曲线　ENR mAb对ENR的抑制曲线如图2所示,回归方程Y=-0·2538X+0·5095,相关系数R2=0·9913。竞争ELISA检测20个空白标准品,所得平均值为1·02

ENR的*工作浓度为1∶1000。2·2·2　灵敏度和标准曲线　ENR mAb对ENR的抑制曲线如图2所示,回归方程Y=-0·2538X+0·5095,相关系数R2=0·9913。竞争ELISA检测20个空白标准品,所得平均值为1·02,标准差为0·085;LOD为(B0-2s)/B0的值所对应的标准曲线的*浓度,代入曲线回归方程计算出LOD=0·05μg/L,即ENR-Kit的灵敏度为0·05μg/L。ENR-Kit的线性检测范围为0·05~101·6μg/L。根据回归方程计算出ENR mAb对ENR的半数抑制浓度IC50为1·1μg/L。图2　ENR-4G1-B3单抗对ENR的抑制曲线Fig.2　Inhibitory curve of 4G1-B3 mAb2·2·3　特异性　由表1可知,*与其他沙星类化合物以及其他常用抗生素类化合物的交叉反应率均小于0·01%

90·5%~98·4%,平均95%,CV为4·6%~9·5%,平均6·8%。说明ENR-Kit具有较高的准确度。2·2·5　基质效应性　如图3所示5种基质标准曲线的IC50分别是:PBS处理液为1·1μg/L、牛奶样处理液为1·45μg/L、鸡肝样品处理液为2·0μg/L、鸡肉样处理液为2·61μg/L、鱼肉样处理液为2·94μg/L。结果说明,尽管不同生物基质对标准品的吸光值有一定影响,但其IC50变化不大,对ENR-Kit的敏感性和检测结果影响不大,可见上述样品的处理方法是可行的。901　6期抗*单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争ELISA试剂盒的研制