Western Blot样品处理方法

1．培养的细胞（定性）：

  ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

  ⑵ 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

  ⑶ 100℃，1min。

  ⑷ 用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。

  ⑸ 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

  ⑹ 待样品恢复到室温后上样。

2．培养的细胞（定量）：

  ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

  ⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。

⑷ 12000g离心，4℃，2min。

⑸ 取少量上清进行定量。

⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。

3．组织：

  ⑴ 匀浆  对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。

⑵ 12000g离心，4℃，2min。

⑶ 取少量上清进行定量。

⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。

(裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM

由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。

1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。

对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。)