细胞培养基纯化实验和包被液的操作过程

细胞培养基纯化实验和包被液的操作过程

　纯化实验操作步骤：

    ．去除培养液；

　　2．×无钙镁PBS洗涤；

　　3．加入×EDTA(0×EDTA用PBS稀释。)37℃孵育5分钟。

　　4．加入ES培养基使失活；

　　5．将细胞转入5ml离心管中离心3min；

　　6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打0－20次。

　　如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。

　　7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；

　　8．将含有细胞的培养基转入明胶包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开。

　　9．建议按：4－：0的比率传代(ATCC)

　　保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到zui低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表来计算传代比率。

包被液的准备：

　　多聚-L-，5μg/ml

　　把75ml多聚-L-和425ml ×PBS混合。贮存在4℃。

　　纤维结合蛋白，μg/ml

　　把0.5ml纤维结合蛋白和500ml ×PBS混合。

　　包被过程：

　　．加入多聚-L-，至少2－3小时（过夜也行）

　　2．吸出多聚-L-

　　3．加入纤维结合蛋白，大约－2小时

　　4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干

　　5．贮存在4℃

　　24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养基孔。有时需要剧烈震荡培养板。