解析细胞MTT的用途及原理

解析细胞MTT的用途及原理

MTT主要有两个用途：

.药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定;

2.细胞增殖及细胞活性测定。

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD 值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

贴壁细胞：

、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入00ul,铺板使待测细胞调密度至000-0000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔00ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况

3、5%CO2，37℃孵育6-48小时，倒置显微镜下观察。

4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5、终止培养，小心吸去孔内培养液。

6、每孔加入50ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡0min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

悬浮细胞：

、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度×06/ml，按次序将①补足的640（无血清）培养基40ul ;②加Actinomycin D（有毒性）0ul用培养液稀释 （储存液00mg/ml，需预试寻找*稀释度，:0-:20）;③需检测物0ul;④细胞悬液50ul（即5×04cell/孔），共 00ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加00ml 640）。

2、置37℃，5%CO2孵育6-48小时，倒置显微镜下观察。

3、每孔加入0 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞使用WST-，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

4、离心（000转x0min），小心吸掉上清，每孔加入00 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡0 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。