快速提取全血RNA的操作步骤

快速提取全血RNA的操作步骤

操作步骤：
*次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量无水乙醇!
使用前将0X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到X.
操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度%,如 ml RLT 中加入0μl β-巯基乙醇.此裂解液现用现配.配好的RLT 4℃可放置一个月.

. 在适合大小的RNase free离心管中加入体积（<.5 ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 （颠倒混匀后）和3体积的红细胞裂解液RLB,颠倒混匀,可轻弹管壁,确保混匀.

2. 室温放置0分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）.
如果RNA降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解.

3. 2,000 rpm离心20秒,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团）,留下完整的管底白细胞团. 

离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2,3.

上清尽可能的吸弃,残留过多会稀释裂解液,造成裂解结合异常,产量纯度降低.

4. 涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀*松散重悬,加入350μl（<0.5 ml全血）或者600μl（0.5-.5ml全血）裂解液RLT,吹打混匀后用手剧烈振荡20秒,充分裂解.病人血样中白细胞数量可能大幅增加,应该适当减少处理量.或者按照350μl（<2x06白细胞）或者600μl（2x06-x07白细胞）比例加RTL.

5. 用带钝针头的一次性 ml（配0.9mm针头） 注射器抽打裂解物 5-0 次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量.

6. 较估计裂解物体积,加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心.

7. 立刻将混合物（每次小于700μl,多可以分两次加入）加入一个吸附柱RA中,（吸附柱放入收集管中）3,000 rpm离心60秒,弃掉废液.

8. 加700μl 去蛋白液RW,室温放置30秒,2,000rpm 离心30秒,弃掉废液.
如果DNA残留明显,可在加入RW后室温放置5分钟再离心.

9. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!）,2,000 rpm 离心30秒,弃掉废液.加入500μl漂洗液RW,重复一遍.

0. 将吸附柱RA放回空收集管中,3,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应.

. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-80℃水浴中加热效果更好）, 室温放置分钟,2,000 rpm 离心分钟.

2. 如果提取全血>0.5 ml或者>2x06白细胞,加30-50μl RNase free water重复步骤,合并两次洗脱液,或者使用*次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍（如果需要RNA浓度高）.

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高5–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择.