PCR反应条件-谷研生物

PCR反应条件-谷研生物

）PCR反应成分
）模板
  单、双链DNA均可。
  不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
  DNA模板一般00ng /00?L。
  模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

2）引物浓度
      0.-0.5 ?mol/L
    浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。

（3）Taq DNA聚合酶
      0.5-2.5 U/50 ?l
    酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
 

4）dNTP（0mM or 2.5mM ）
     含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP
    dNTP浓度取决于扩增片段的长度
    浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量
    dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。
5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。
   Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。
   Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
2）循环参数
变性 
    使双链DNA解链为单链
    94℃， 30-60秒
（2） 退火 
    温度由引物长度和GC含量决定。
    增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
引物设计：
（）序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源
    序列。
（2）引物长度以5-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
3）延伸
      70-75℃,一般为72℃
      延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数
     主要取决于模版DNA的浓度
      一般为25-35次
       次数过多：扩增效率降低
                 错误掺入率增加