液相色谱法分析人参皂苷
摘要：人参皂甙compound—K（C—K）在人参中的含量极低，但它是其他含量较高的人参皂甙Rbl和Rb2等在人体肠道内的主要降解产物和zui终吸收形式，具有很高的生物活性。参照药典2010版采用501液相色谱仪来测定了人参总皂甙发酵液中c—K的含量。色谱条件为：VertexC18柱；乙腈-水（体积比为48：52）溶液为流动相，流速1.0mL/min；紫外检测波长203 nm；柱温35℃；外标法定量。结果表明：C—K的质量浓度为0.05～0.8g/L时，其峰面积与质量浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.9998。方法的检测限（S/N=3）为2.5mg/L，峰面积测定值的相对标准偏差（n=6）为2.2%。测定栽培人参总皂甙及三七茎叶总皂甙微生物发酵液中c—K 的平均加标回收率（ n=3）分别为98.6%和99.7%。该方法快速简便，准确可靠，可用于c—K 的制备研究及药物开发。
关键词：液相色谱法；501液相色谱仪，人参皂甙compound—K；人参；三七
人参在我国和东亚的应用已有数千年，作为滋补强身的药材也已闻名*。人参皂甙（ginsen—oside）被认为是人参各种药理和生物活性的主要有效成分，属于三萜皂甙，其中人参皂甙Rbl，Rb2。Rc，Re和Rgl等含量较高。人参皂甙compound-K（C-K）[20-O-D-glucopyranosyl-20-（S）-proto-panaxadio1]，其分子式为C16H64O8 ，在人参中的含量极低，但它是人参皂甙Rbl，Rb2和Rc在人体肠道内的主要降解产物和zui终吸收形式。近年来，体内体外试验研究发现，许多生物学活性都是由该化合物引起的，如抑制肿瘤细胞的增殖、浸润和转移，抗过敏，抑制化学致癌剂诱导的染色体基因突变等 ，因此对它的研究越来越受到重视。目前，C—K主要是通过微生物发酵法和酶法获得 。C—K含量测定方法学的研究对人参皂甙发酵液及其制品的质量控制、发酵工艺的优化以及C—K体内代谢吸收的研究均有十分重要的意义。采用液相色谱法（HPLC）测定人参皂甙含量，在国内外均有报道 ，而有关人参及其制品中C—K的含量测定则未见报道。本文采用反相液相色谱法（RP—HPLC）测定栽培人参总皂甙和三七茎叶总皂甙微生物发酵液中C—K的含量，方法具有简便快速、结果准确等优点，且样品经提取、浓缩、定容后不需要进一步纯化。
l 实验部分
1．1 仪器、试剂及样品
501二元梯度泵；可变波长紫外检测器和GLP色谱工作站；Acculab ALC一1 l0．4型分析天平（德国Sartorius公司）；RE一52A 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。甲醇、乙醇（分析纯，上海化学试剂公司）；乙腈（HPLC纯，DIKMA公司）；超纯水（由德国Sartori—US公司Arium 631系列实验室超纯水器制备）。C-K标准品：本实验室自制；栽培人参总皂甙：抚顺鑫泰参茸保健品公司提供，总皂甙含量81．56％ （质量分数）；三七茎叶总皂甙：云南红云生物技术公司提供，总皂甙含量80．52％ （质量分数）。
1．2 色谱条件
色谱柱：VertexC18 4.6×250mm,5um；流动相：乙腈-水（体积比为48：52）溶液，流速1.0mL／min；检测波长：203nm；柱温：35℃ ；进样量：l0uL。
1．3 标准溶液的制备
精密称取C-K标准品5.0mg，用甲醇溶解并定容至5mL，配制成1.0g／L的标准储备溶液。从中准确吸取适量配成0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g／L的系列标准溶液。
1．4 样液的制备
1．4．1 人参总皂甙样液的制备
分别准确称取30.0mg栽培人参总皂甙和三七茎叶总皂甙，各用甲醇配成10mL质量浓度为3g／L的溶液，经0.45m滤膜过滤后作为测定样液。1.4.2人参总皂甙发酵液样品溶液的制备取栽培人参总皂甙和三七茎叶总皂甙的发酵液各30mL（人参总皂甙质量浓度为5g／L），先用30mL乙醇浸提24h，再过滤除去菌体。滤液减压蒸干后，用5mL甲醇溶解，将溶解液高速离心（12000r／min）lOmin。准确移取上清液1mL，用甲醇稀释30倍，经0.45 izm 滤膜过滤后供试。
1．5 定量方法
采用外标法定量。以峰面积对质量浓度做工作曲线，再由试样中组分的峰面积求出试样中组分的实际浓度。
2 结果与讨论
2．1 人参皂甙compound-K 的色谱行为本研究在乙腈一水流动相体系中进行，选择乙腈与水的体积比分别为30：70，43：57，48：52，55：45，60：40，结果以乙腈与水的体积比为48：52的分离效果。在此条件下不仅C—K与其他皂甙类成分达到基线分离，而且峰形好，检测灵敏度高。C—K标准品、发酵前后栽培人参总皂甙及三七茎叶总皂甙的色谱图见图1。
结语
本方法的建立为菌株改良、发酵与分离工艺优化，提高发酵转化率和分离提取的收率提供了一个有效的分离分析手段，为实现人参皂甙compound．K生产工业化及开发抗肿瘤新药奠定了基础。
参考文献：
人参皂苷、三七皂苷液相色谱法
[1] Akao T，Kida H，Kanaoka M ．Hattori M．Kobashi K JPharm Pharm acol，2011． 50：l l55
[2] Lee S J，Sung J H，Lee S J，Moon C K．Lee B H．CancerLetters，2011，l44（1）：39
关键词：501液相色谱仪，人参皂苷，液相色谱法
