实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。

 一、 样品准备

1． 准备好 25cm2细胞培养瓶或 60mm细胞培养皿的待测培养细胞（5 X 106细胞）

2． 小心加入 xx 毫升预冷的 SBJ 清理液（试剂 A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞

5． 加入 xx 毫升 SBJ 清理液（试剂 A），混匀细胞

6． 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升S B J   裂解液（试剂 B），充分混匀

10．转移到预冷的 1.5 毫升离心管

11．强力涡旋震荡 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分钟

13．放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM）

14．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管

  15．移取 2  微升进行蛋白定量测定

16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清）

2． 设定好分光光度仪（温度为 30℃）：波长为 660nm，并置零

3． 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管

4． 按下表分别加入S B J   阴性液（试剂 D）和 SBJ标准液（试剂 H）到每个离心管， 混匀

 5． 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表：

三、 标准曲线测定

1． 移取 xx 微升 SBJ 阴性液（试剂 D）到新的比色皿

2． 加入 5 微升上述配制的标准液

3． 在 37℃温度下孵育 10 分钟

4． 加入 xx 微升 SBJ终止液（试剂 F），混匀

5． 加入 xx 微升 SBJ 显色液（试剂 G），混匀

6． 室温下静置 15 分钟，避免光照

7． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

8． 重复实验步骤 1 至 7 四次

9． 构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为吸光单位（A）；横座标（X 轴）为标准磷浓度

    （微摩尔/升）

四、 样品背景测定

   1． 移取 xx 微升S B J 缓冲液（试剂 C）到新的比色皿

2． 加入 5 微升待测样品（总量 100 微克细胞裂解萃取液蛋白）

3． 在 37℃温度下孵育 10 分钟

4． 加入 xx 微升 SBJ 终止液（试剂 F），混匀

5． 加入 xx 微升 SBJ 显色液（试剂 G），混匀

6． 室温下静置 15 分钟，避免光照

7． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

8． 根据标准曲线获得样品背景对应     磷浓度

五、 样品活性测定

1． 移取 xx 微升 SBJ缓冲液（试剂 C）到新的比色皿

2． 加入 5 微升待测样品（总量 100 微克细胞裂解萃取液蛋白）

3． 在 37℃温度下孵育 2 分钟

4． 加入 xx 微升 SBJ 反应液（试剂 E）

5． 在 37℃温度下孵育 10 分钟

6． 加入 xx 微升 SBJ 终止液（试剂 F），混匀

7． 加入 xx 微升SBJ显色液（试剂 G），混匀

8． 室温下静置 15 分钟，避免光照

9． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

10．根据标准曲线获得样品活性对应磷浓度

 {[根据标准曲线获得样品活性对应磷浓度（微摩尔/升）—根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度（微摩尔/

升）]X 5（体系倍数）X 样品稀释倍数}÷ 10（反应时间；分钟）＝纳摩尔磷/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度） 毫克/毫升＝纳摩尔磷/毫克/分钟

注意事项

1． 本产品为 25 次操作，包括 5 次标准测定

2． 操作时，避免污染母液

3． 操作时，须戴手套

4． SBJ终止液（试剂 F）和S B J 显色液（试剂 G）具有腐蚀性，避免直接用手接触

5． 样品切忌使用磷酸缓冲液和脱氧胆酸纳处理

6． 比色测定后，比色皿须清洗*

7． 如果用户没有 660nm 波长，可以使用 600 至 660nm 的任一波长替代

8． 显示绿色表明具有较强酶活性

9． 空白对照读数应小于 0.2

10．建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/5 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；

11．钙调神经磷酸酶活性单位浓度定义：在 37℃温度下，pH 8.0 的情况下，每单位酶在单位时间内（每分 钟）释放 1 微摩尔的磷

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确