操作流程如下：

（1）待测样品孔中每孔加入待测样品100μl，每种样品设3个平行孔；设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液100μl；另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液100μl。

（2）酶标板置4℃，包被过夜。

（3）洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去），之后将洗涤液注满板孔，浸泡1-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

（4）阴性对照孔每孔加入PBS 50μl，样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。

（5）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。

（6）洗板，同（4）。

（7）每孔加1:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液 100μl。

（8）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。

（9）洗板，同（4）。

（10）每孔加TMB显色液 100μl，轻轻混匀10s，置37℃暗处反应15-20min。

（11）每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。

（12）分别测450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，最终测得的OD值为两者之差（W1-W2），以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

（13）数据处理：在得出标本（S）和阴性对照（N）的 OD值后，计算S/N值。S/N≥2.1为阳性判定标准。

我司提供免费代测服务，凡购买我司试剂盒的用户，只收取试剂盒的费用,其他辅助试剂全部免费。我们将根据实验工作量和难易程度，双方协定实验周期，保质保量完成委托实验，并将实验结果和材料用特快专递免费寄送到您手中。

从标本收集、保存、预试验、实验、数据分析等全实验过程提供完整的技术指导。

公司采用的全是进口原材料研，发灵敏性高，高效性，吸附均匀、吸附性好，回收利用率高、可靠性强，无效包退包换，公司提供免费代测服务，各种种属ELISA试剂盒产品齐全，质量可靠。

实验室注意事项：

1、所有试剂不能与皮肤直接接触。

2、务必使用洁净的药勺，量筒或滴管取用试剂，不准用同一种工具同时连续取用多种试剂。

3、取完一种试剂后，应将工具洗净、擦干后，方可取用另一种试剂。

4、试剂取用后一定要将瓶塞盖紧，不可放错瓶盖和滴管，绝不允许张冠李戴，用完后将瓶放回原处。

5、已取出的试剂不能再放回原试剂瓶内。

实验标准品图：

40 ng/L，5号标准品，150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

20 ng/L，4号标准品，150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

10 ng/L，3号标准品，150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

5 ng/L，2号标准品，150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

2.5 ng/L，1号标准品，150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

标本的采集与保存：

1、血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2 小时或4oC 过夜，然后1000×g 离心20 分钟，取上清即

可，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：用EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30 分钟内于2-8oC 1000×g 离心15 分钟，

取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，但应避免反复冻融。

3、组织匀浆：

1） 取适量组织块，于预冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）；

2） 可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加入5-10mL 预冷PBS 进行充分研磨，该过程需在冰上进行（有条件实验室可选用机器匀浆）；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过

试剂和样本的控制方法：

一、试剂

1.试剂的选择：国家明确要求要采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关，我司严格按照国家标准进行，已获得国家承认的“三证"，每一个产品都有对应的批号，只要客户提前下单，我们就能为您提供新批次的产品，不必担心会有过期的试剂。我司的试剂，值得您选择。

2.试剂的准备：先将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20-30 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。

二、样本

1.内源性干扰因素：包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等；

类风湿因子的控制方法：

①用F(ab)2替代完整的IgG；

②标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理；

③检测抗原时，可用加入到标本稀释液中使RF降解；

补体的控制方法：

①用EDTA稀释标本；

②56℃ 30 min加热血清使C1q灭活；

2.外源性干扰因素：包括标本溶血、细菌污染、保存时间过长或凝固不全等；

控制方法：采血时规范操作，采集的血液勿用力震荡，以防溶血；收集标本时采用无菌试管，经检测后再低温冻存；保存时间不宜过久，检测时尽量采用新鲜标本；对于凝固不全的血标本可适当加入抗凝剂，并放入37℃水中1 h，待充分凝固后再离心分离血清。

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