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上海博湖生物科技有限公司
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PCR实验预准备事项
2023-12-11 阅读(172)
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR实验是分子生物学中常见用的实验之一，在基因扩增、核酸检测、基因检测等方面广泛应用。PCR实验前的准备:
在开始PCR实验之前，必须准备好DNA模板（基因组DNA或逆转录制备的cDNA）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)
1、DNA聚合酶。有许多商业 DNA 聚合酶，它们具有不同的特性。一般分为两类：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想对没有任何突变的特定 DNA 片段进行 PCR，请选择高保真聚合酶。如果只是想检测特定序列的存在，就选择普通的Taq聚合酶。如果要对T-vector连接的片段进行PCR，要注意，因为大多数高保真聚合酶的产物都没有A-tailing，所以应该选择普通的Taq聚合酶或在PCR实验后添加A-tailing。
2、引物的特异性影响 PCR 成功的概率，良好的引物设计对 PCR 扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时，应仔细考虑以下几个原则：
①引物的长度。PCR引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。
②熔化温度(Tm)。Tm 定义为在此温度下，DNA 双链体的一半将解离成单链 DNA。52-58C 范围内的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量应为 40-60%。
④许多软件可用于引物设计，例如primer5和Oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。
