细胞培养操作规程:
一.培养基及培养冻存条件准备:
1)准备RPMI-1640培养基,90%;优质胎牛血清,10%。
2)培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配,液氮储存。
二.细胞处理:
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于悬浮细胞,传代可参考以下方法:
方法一:收集细胞,1000RPM,常温条件下离心5分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
公司产品仅用于科研以下是细胞的订购信息:
英文简称:PAXCS-012细胞
产品名称:源胰腺癌细胞
规格:T25
形态特性:上皮细胞
生长特性:贴壁生长
特征特性:
培养条件:
传代方法:1:3传代,CQ-4天传1次
货号:CS-X63937
细胞培养的优点:
1.研究的对象是活细胞
在实验过程中,根据要求可始终保持细胞活力,并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况,包括活细胞的形态、结构、生命活动等。
2.研究条件可以人为控制
pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件,可以根据实际需要进行人为的控制,同时,可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察,这些因素同样可以处于严格控制之下。
3.研究的样本可以达到比较均一性
通过细胞培养一定代数后,所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞,需要时,可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。
4.研究内容便于观察、检测和记录
采用各种研究技术:如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等各种仪器设备。
注意事项:
(1)冻存前细胞状态,细胞在对数生,细胞密度适合,刚刚发生细胞融合,过密或连成片的细胞状态不好,而且消化时不容易分散;
(2)冻存的密度不宜过低,10的6次方-7次方的数量级比较好,我冻存的细胞一般T25培养瓶(5*107),一瓶冻一管(1.5ml冻存管),10cm培养皿(大概10的8次方个细胞)分成两管。
(3)消化和吹打,切忌消化过度,吹打不可太用力,不要吹出好多泡泡。消化后立即加入*培养基吹打哦,不是加入冻存液再吹打。
(4)离心后加入冻存液。冻存液中FBS的用量对于肿瘤细胞株而言要求不是很严格,我从10%-90%都用过,问题不大,个人认为10%-20%可以了,能节约处就节约点嘛!另外,冻存液可以在处理细胞前配置,放在4度冰箱预冷。细胞离心后直接用预冷的冻存液重悬,移入冻存管。
(5)关于“慢冻”,传统的方法,LLC细胞冻存管用棉花包好,4度2h,-20度2h或更长,-80度过夜,最后液氮。对于条件较好的实验室和细胞冻存数量多的实验室,使用程序降温盒,内装异丙醇,在-80度并内可以逐渐降温,很方便,省了包棉花、4度、-20度了。
实验报告
一、产分离与培养:
1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,最后将成1mm3左右大小;
2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置;
3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织*被消化;
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培养箱中培养;
5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养;
二、免疫荧光鉴定:
1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min;
2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;
3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min;
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗,然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜;
5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗, 37℃条件下放置1h;
6、用PBS冲洗3次,每次10min,最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
细黄链霉菌注意事项: 仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的,不可用于类或动物的临床诊断或治疗,非药用,非食用
拉丁属名: Streptomyces flavospinosporus
黄孢链霉菌注意事项: 仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的,不可用于类或动物的临床诊断或治疗,非药用,非食用
苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种注意事项: 仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的,不可用于类或动物的临床诊断或治疗,非药用,非食用
粘质沙雷氏菌拉丁属名: Pseudomonas aeruginosa
铜绿假单胞菌拉丁属名: Streptomyces lavendularectus
浅紫灰直丝链霉菌用途: 固氮
根瘤菌规格: 1ml甘油管1支,20ul质粒,一般次日下午
pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro用途: 用于B突变株的互补实验
大肠杆菌用途: 幼时可食用,也可药用,能消肿,止血,清肺,解,可治慢性偏桃体炎
黑伞属拉丁属名: Bacillus brevis
短芽孢杆菌拉丁属名: Bacillus smithii
史氏芽孢杆菌拉丁属名: Ornithinibacillus sp.
鸟氨芽孢杆菌属菌种拉丁属名: Bacillus subtilis
枯草芽胞杆菌拉丁属名: Hansenula anomala var. anomala
异常汉逊酵母异常变种拉丁属名: Natrinema pallidum
PAXCS-012细胞巯咪唑/他巴唑/2-巯基-1-基咪唑英文名称: Big Endothelin-1 (1-38), human抗猪瘟病抗体包装5g
氧普英文名称: Big Endothelin -1 (1-39),porcine胰脂肪酶相关蛋白1抗体包装100g
胶体果胶铋英文名称: BNP-32, rat蛋白质磷酸酶2A亚基3抗体包装500g
伐伦克林英文名称: Bombesin缺陷性分配同源物β抗体包装10MG
托特罗定英文名称: Bradykinin过氧化酶活化增生受体γ抗体包装100mg
溴莫尼定英文名称: Bradykinin (1-5)中心粒蛋白抗体包装1G
卡泊三英文名称: Bradykinin (1-6)PELO蛋白抗体包装500MG
卡洛芬英文名称: Bradykinin (1-7)P因子/备解素抗体包装5g
英文名称: BuccalinPSF2蛋白抗体包装25g
英文名称: Calcitonin, chicken肾上腺皮质发育异常同源蛋白抗体包装5g
拉呋替丁英文名称: Calcitonin, human阿黑皮素原抗体包装5g
拉科酰英文名称: Calcitonin, rat肠道病71型/手足口病病抗体包装5g
拉莫三英文名称: Calcitonin Gene Related Peptide (8-37), human蛋白质磷酸酶2B抗体 PP2A β PP2A-β包装100g
来米特英文名称: Calcitonin Gene RelatedPeptide II, human胞粘蛋白1抗体抗体包装25g
英文名称: Calcitonin Gene RelatedPeptide, rat/蛋白激酶18包装5g