FITC-Phalloidin FITC-鬼笔环肽

产品信息

产品简介

鬼笔环肽（Phalloidin）的结合阻止丝状肌动蛋白（微丝）的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。

绿色荧光FITC标记的鬼笔环肽会选择性结合F-肌动蛋白。鬼笔环肽衍生物经常以纳摩尔浓度使用，常在甲醛固定和透化的组织切片、细胞培养或无细胞实验中用于标记、鉴定和定量F-肌动蛋白的便捷探针。鬼笔环肽与肌动蛋白丝的结合比与肌动蛋白单体的结合要紧密得多，从而导致肌动蛋白亚基从丝端解离的速率常数降低，从而通过防止丝解聚而基本稳定了肌动蛋白丝。而且，发现鬼笔环肽抑制F-肌动蛋白的ATP水解活性。鬼笔环肽在细胞中不同浓度下的功能不同。当以低浓度引入细胞质时，鬼笔环肽将聚合度较低的胞质肌动蛋白和纤维蛋白吸收到聚集的肌动蛋白聚合物的稳定“岛”中，但它不会干扰应力纤维，即厚的微丝束。鬼笔环肽的性质是研究F-肌动蛋白在细胞中分布的有效工具，方法是用荧光类似物标记鬼笔环肽并将其用于染色肌动蛋白丝以进行光学显微镜观察。鬼笔环肽的荧光衍生物已被证明在定位活细胞或固定细胞中的肌动蛋白丝以及体外观察单个肌动蛋白丝方面非常有用。荧光鬼笔环肽衍生物已被用作高分辨率研究肌动蛋白网络的重要工具。

产品性质

1.分子式（Molecular Formula）：C56H60N10O15S2

2.分子量（Molecular Weight）：1177.3

3.最大激发/发射波长（Ex/Em）:495~496/513~516nm

4.多肽序列（Sequence）:FITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3   to 6)

5.外观（Appearance）:黄色粉末（冻干粉）

6.溶解性（Solubility）:溶于DMSO、DMF、甲醇或者乙腈水溶液（20%）

本品以1000×储存液形式（溶于DMSO）提供，按照100µl/孔（96孔板），总共可做300T。

warbio 生物也提供粉末形式，浓度自行配置使用, 可直接溶于甲醇或DMSO配置成适当浓度的储存液。之后用PBS或PBS+1% BSA稀释到合适的工作浓度。常用工作浓度范围80-200nM。

注意事项：    

鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。毒性较大，戴上手套操作。

自备实验材料

1.1 FITC Phalloidin（货号LX4520）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（货号 SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗荧光淬灭剂

1.6 （可选）即用型PI染色液（货号 4209）

1.7 （可选）BSA, Standard Grade（货号 J8660）

1.8 盖玻片密封液（透明指甲油）

操作步骤

1. 工作液准备

1）对于FITC标记鬼笔环肽（货号：LX4520）

本品以溶于甲醇的20µM储存液形式提供，总量为300µl。按照100 nM的工作液浓度来换算，可制备总量为60 ml的工作液。建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。

开始实验前，使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200nM。工作液现配现用。

2）对于FITC标记鬼笔环肽（货号：LX2226）

Warbio生物冻干粉形式提供，分子量为1177.3，总量为1mg。可先用甲醇或者DMSO充分溶解配制成20~100µM的储存液。如，加入8.494ml甲醇到1mg鬼笔环肽即得到100µM等量的储存液，根据单次使用量，进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。

开始实验前，使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200nM。工作液现配现用。

2. 染色步骤

1）细胞爬片生长24h，使其密度达到50%汇合度。

2）吸掉培养液，37℃预热的1×PBS（pH 7.4）清洗细胞2次。

3）使用溶于PBS的4%溶液进行细胞固定，室温固定10min。

注意：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。

4）室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。

5）室温条件下，用丙酮（≤-20℃）脱水或者用0.5% Triton X-100溶液透化处理5min。

6）室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。

7）取200µl配制好的 FITC标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育30min（通常情况下，4℃~37℃孵育皆可）。

注意：为了降低背景，可于FITC标记的鬼笔环肽工作液内加入1% BSA；另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可将盖玻片转移到一个密封的容器内。

8）用PBS清洗盖玻片3次，每次5min。

9）使用200µl DAPI溶液（浓度：100 nM）对细胞核进行复染，约30s。

10）用PBS清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂，然后用指甲油封片。此法制备的标本玻片可置于4℃避光保存，通常6个月内可继续做F-actin染色分析。

注意：也可以直接使用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂（合并步骤9）10），简化步骤。

11）荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择FITC激发/发射滤片（Ex/Em=496/516nm）和DAPI激发/发射滤片（Ex/Em=364/454nm）。

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