蛋白质提取方法
在0.2 ml均质缓冲液(0.1 M EDTA, 0.12 M Tris-HCl, pH6.8, 4% SDS, 10%甘油,10%2-qiujiyichun )中提取大约100 mg的植物材料,在1.5ml Eppendorf管中提取雌蕊和少量的沙。再加入0.8 ml缓冲液,将提取液充分混合。碎片在14000 rpm的转速下被离心成球。上清液与2x SDS上样缓冲液混合,95℃煮沸10min。(未检测到BAK1带)
将大约200mg的植物材料在含有液氮的砂浆中研磨,并收集到2.0 mL的微管中。加入2x SDS上样缓冲液0.2 ml (0.125M Tris-HCl (pH 6.8), 10% 2-qiujiyichun,4% SDS, 10%蔗糖,0.004% BPB),涡旋混合2min, 95℃煮沸10min。碎片在14000 rpm的转速下被离心成球。收集上清液。(BAK1乐队可视化)
免疫印迹法
用10% SDS-PAGE分离30 μ l,使用Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad)将其印迹7min至Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer pack。用4%的牛奶在TBS-T中搅拌1h/RT阻断印迹。将印迹用稀释1:20 00的一抗在4%的牛奶中孵育,在TBS-T中搅拌1h/RT。将抗体溶液倒出,在TBS-T中搅拌,在RT下洗涤3次,5min。用山羊抗兔IgG (H&L), HRP标记(AS09 602 Agrisera),搅拌1:2000 1h/RT孵育印迹。印迹在TBS-T中RT搅拌洗涤3次,15分钟,并用AgriseraECL超亮显影5分钟。曝光时间为1min。