货号 | 名称 | 规格 |
SH0115 | NADP磷酸酶（NADPase）检测试剂盒（分光光度法 50T/48S） | 50管/48样 |
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
NADPase主要存在于植物组织中，是生物体内weiyi催化NADP+降解为NAD+的酶，与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。
测定原理：
NADPase能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。
组成：
产品名称 | SH0115-50T/48S | Storage |
提取液： | 60ml | 4℃ |
试剂一：液体 | 30ml | 4℃ |
试剂二：粉剂 | 1瓶×5 | -20℃ |
试剂三：粉剂 | 1瓶 | 4℃ |
试剂四：粉剂 | 1瓶 | 4℃ |
试剂五：液体 | 25ml | RT |
试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液 | 10ml | 4℃ |
说明书 | 一份 | |
试剂二：粉剂×5支，-20℃保存；用时每支加入1 ml试剂一充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。
试剂四：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。
试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液 10ml×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/ml 标准磷应用液配制：将试剂六20倍稀释，即取 0.5ml试剂六加9.5蒸馏水，充分混匀。
定磷试剂的配制：按H2O: 试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂zuihao用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水
样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、酶促反应
试剂名称（μl） | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 300 | 300 |
试剂二 | 100 | 100 |
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热5min
样本 | 100 | |
蒸馏水 | 100 |
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应30min后，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 25℃离心5min，取上清
2、定磷
标准管 | 空白管 | 测定管 | 对照管 | |
0.5μmol/ml标准磷应用液 | 100 | |||
蒸馏水 | 100 | |||
上清液 | 100 | 100 | ||
定磷试剂 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴30min，冷却至室温，在 660nm处，蒸馏水调零，记录各管吸光值。
注意事项：
1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用蒸馏水冲干净。zuihao用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。
2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。
NADPase酶活性计算：
1、按组织蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。
NADPase (μmol/h/mg prot)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷
(V样×Cpr)÷T=5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
定义：每小时每g组织NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。
NADPase (μmol/h/g鲜重)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管）×
V总÷(W× V样÷V样总)÷T=5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准管：标准管浓度，0.5μmol/ml；V总：酶促反应总体积，0.5ml；V样：加入样本体积，0.1ml ；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，0.5小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本鲜重，g。
