第二相聚丙烯酰胺凝胶的选择主要取决于需要分离蛋白质的相对分子质量的范围，这与单相的聚丙烯酰胺凝胶电泳的选择是相同的。当蛋白质相对分子质量在15 000～200 000时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。SDS—PAGE不仅可分离蛋白质，且可在一定范围内粗略测定蛋白质的相对分子质量。其主要步骤如下。
（1）凝胶配制及灌胶：胶浓度越高，所分离蛋白质的相对分子质量范围也越大。薄的胶，其染色和脱色快，且背景染色浅；厚的胶则上样量大，但不易碎。
（2）*相胶条的平衡：平衡的目的是让一相IPG胶条更好地适应二相SDS—PAGE的电泳环境，防止电内渗（electroendosmosis）以及提高蛋白质向第二相的转移效率。平衡母液基本组成：Tris（50 mmol／l pH 6．8）+Urea（6 mol／L）平衡一般分两步，每步不超过15min。*步平衡母液中加入1％DTT，使蛋白质保持还原状态；第二步平衡母液中加入2．5％碘乙酰胺，使蛋白质烷化，防止电泳时蛋白质再氧化。
（3）*相胶条的转移：需注意IPG胶条放人二相凝胶后，胶条的侧面及与二相凝胶间不能有气泡，以利蛋白质的转移。
（4）电泳：初始电压为分离电压的一半，初始电泳时间不能过短，以保证大分子量蛋白质也*转入二相凝胶。
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