主要用途

细胞二酰基甘油酰基转移酶-1（Diacylglycerol acyltransferase-1；DGAT1）活性光度法定量检测试剂是一种旨在运用油酰和二酰基甘油作为底物，在DGAT2抑制剂的存在下，通过转移酶的催化，释放出巯基，进而使用Ellman试剂，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用光度法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液、微粒体，或纯化酶样品二酰基甘油酰基转移酶-1的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

二酰基甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase；DGAT；EC2.3.1.20），又称为酰基二酰基甘油酰基转移酶（acyl-CoA:1,2-diacylglycerol acyltransferase）或甘油三酯合成酶（triglyceride synthetase），存在于哺乳动物、植物、真菌/酵母和细菌等生物体内，主要位于微粒体内的膜结合型蛋白，尤其在脂肪组织高度表达，是甘油三酯生物合成（Kennedy）通路中的终端步骤。催化由酰基上的脂肪酸转移到二酰基甘油分子sn-3部位上的酰化反应（acylation），产生甘油三酯。且通过变构调理（allosteric modulation）和二价修饰（covalent modification）等调节。甘油三酯是中性脂质，无极性，不溶于水，是组织细胞能量储存的一种形式。甘油三酯是导致肥胖症的重要原因，而高甘油三酯血症（hypertriglyceridemia）是心血管疾病的的危险因子，由此降低甘油三酯水平成为药物研究的重要课题，其中二酰基甘油酰基转移酶成为药物开发的靶标，以达到降低甘油三酯水平，同时降低血浆中极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白（VLDL/LDL）含量。二酰基甘油酰基转移酶有2种同工酶：DGAT1和DGAT2。它们没有序列同源性，但催化类似的反应。DGAT1是肥胖症的治疗目标。基于底物油酰（oleoyl CoA）和二酰基甘油，在DGAT2敏感性抑制剂（niacin）存在的情况下，通过二酰基甘油酰基转移酶1的催化，产生甘油三酯，并释放出巯基（CoA-SH），进而与Ellman试剂5，5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析二酰基甘油酰基转移酶1的活性。其反应系统为：

              DGAT1

Oleoyl-CoA  +  1,2-diacyl-sn-glycerol     →   triglyceride   +   CoA-SH

 DTNB  +   CoA -SH  →   TNB  +  CoA -S-S-TNB

产品内容

清理液（Reagent A）        120毫升

裂解液（Reagent B）         12毫升

缓冲液（Reagent C）          6毫升

反应液（Reagent D）        500微升

底物液（Reagent E）          1毫升

阴性液（Reagent F）          500微升

显色液（Reagent G）             200微升

产品说明书                1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和显色液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和显色液（Reagent G）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

（微型）台式离心机：用于样品制备

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤

一、 样品准备

1． 准备好75cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）

2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用消化）

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管——此为总蛋白样品

15． （选择步骤）放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g

16． （选择步骤）小心抽去上清液

17． （选择步骤）加入100微升裂解液（Reagent B），混匀细胞颗粒群——此为微粒体样品

18． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

19． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，并置零

2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和显色液（Reagent G）避免光照

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 样品背景对照测定

1． 移取135微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升底物液（Reagent E）

3． 加入20微升阴性液（Reagent F）

4． 加入20微升待测样品（500微克总蛋白）（注意：样品须清澈）

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在37℃温度下孵育30分钟

7． 加入5微升显色液（Reagent G），混匀

8． 在37℃温度下孵育5分钟

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照 

四、 样品活性测定

1． 移取135微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升反应液（Reagent D）

3． 加入20微升底物液（Reagent E）

4． 加入20微升待测样品（500微克总蛋白）（注意：样品须清澈）

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在37℃温度下孵育30分钟

7． 加入5微升显色液（Reagent G），混匀

8． 在37℃温度下孵育5分钟

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数 

五、计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.20（体系容量；毫升）]÷[0.02（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 30（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔巯基/分钟

六、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：样品背景对照和样品活性

2． 分别移取135微升缓冲液（Reagent C）到96孔板的所有孔里

3． 加入20微升阴性液（Reagent E）到样品背景对照孔里

4． 加入20微升反应液（Reagent D）到样品活性孔里

5． 分别加入20微升底物液（Reagent E）到所有孔里

6． 分别加入20微升待测样品（500微克总蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈）

7． 轻轻摇动96孔板

8． 在37℃温度下孵育30分钟

9． 分别加入5微升显色液（Reagent G）到所有孔里

10． 轻轻摇动96孔板

11． 在37℃温度下孵育5分钟

12． 即刻放进酶标仪检测：获得背景和样品活性读数

13． 活性计算：

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.20（体系容量；毫升）]÷[0.02（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 0.5（光径距离；厘米）X 30（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔巯基/分钟

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 建议使用微粒体样品取代总蛋白样品，避免干扰

4． 样本背景和样品活性测定需要平行测定

5． 样品须澄清，至关重要

6． 测定值由低到高变化

7． 光度测定后，比色皿须清洗*

8． 反应时间持续30分钟

9． 建议待测样本为总蛋白，其蛋白浓度为500微克/20微升；如果为微粒体蛋白样品，其蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11． 用户可以使用二酰基甘油酰基转移酶-1抑制剂(1R,2R)-2-[[4'-[[Phenylamino)carbonyl]amino] [1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonyl]cyclopentanecarboxylic acid（IC50=24纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照

12． 二酰基甘油酰基转移酶-1单位活性定义为：在37℃，pH 7.4条件下，每分钟内释放1微摩尔巯基所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列二酰基甘油酰基转移酶分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感