体液基质金属蛋白酶1活性荧光定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

体液基质金属蛋白酶1（MMP2）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针MCA供体和DAP/DNP受体双重标记的多肽底物PLGLAR，在特定抑制剂存在与否的情况下，受到MMP1蛋白酶的水解，解离抑制基团，产生荧光产物，即采用荧光法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体体液包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液等样品中基质金属蛋白酶1的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。

技术背景

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-2，又称明胶酶A （gelatinase-A）或IV型胶原酶（type IV collagenase），其前体分子量为72kDa，激活后分子量为62和56 kDa。它在血清或细胞上清中浓度通常为10至200纳克/毫升。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤维连接蛋白（fibronectin）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白-5 （laminin-5）、前体肿瘤坏死因子-α（pro-TNF-α）和神经（蛋白）聚糖（neurocan）。基质金属蛋白酶-2与肿瘤发展与转移、血管形成、动脉粥样硬化等疾病有关。基质金属蛋白酶-1，又称间隙性胶原酶 （interstitial collagenase）或成纤维细胞胶原酶（fibroblast collagenase），其前体分子量为52（未糖基化）和57（糖基化）kDa，激活后分子量为42和47 kDa。它的作用目标是纤维胶原蛋白（fibrillar collagens）。基质金属蛋白酶-1与风湿性关节炎（结缔组织降解）、牙周病（periodontal diseases）和肿瘤发展转移有关；基质金属蛋白酶-1缺失将导致肌肉骨骼综合种（musculoskeletal syndrome）。基质金属蛋白酶1的活性检测通过荧光共振能量转移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即传递激发状态的能量由处于较短波长的供体（donor）到覆盖供体波长的受体（acceptor），使得距离依赖性反应的供体的散发光子淬灭（quench）。基于多肽底物PLGLAR两端标记的供体荧光探针7-甲氧基（7-methoxy courmarin）受到另一个受体基团二硝基苯二氨基异丁酰[N-3-（2,4-dinitrophenyl）-L-α-β-diaminopropionyl；Dap]的抑制而荧光淬灭（quench）。在特异性抑制剂GM1489（N-[(2R)-2-(Carboxymethyl)- 4-methylpentanoyl]- L-tryptophan-(S)-methylbenzylamide）存在与否的条件下，一旦多肽的Gly-Leu键受到MMP1水解，释放出具有强烈荧光的7-甲氧基多肽片段，据此根据其荧光强度（激发波长330nm，散发波长400nm）的变化，来定量测定基质金属蛋白酶1的特异活性。其反应系统为：

产品内容

缓冲液（Reagent A）        毫升

底物液（Reagent B）        微升

标准液（Reagent C）             微升

专性液（Reagent D）          微升

产品说明书            1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent B）和标准液（Reagent C）避免光照，有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应孵育

黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备

选择一：血浆样品

1． 准备好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）

2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里

3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）

5． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

6． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

选择二：血清样品

1． 准备好不含抗凝剂的储存管 

2． 抽取1毫升血液，置于储存管里

3． 室温下，静置30分钟，直至血液凝结

4． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）

5． 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）

6． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

7． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

选择三：尿液/脑脊液/唾液/精液样品 

1． 准备好1.5毫升离心管

2． 移取1毫升液体到离心管 

3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管 

5． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

6． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存