蛋白芯片的发展

　　蛋白芯片是一种高通量监测系统，通雵过靶分雵子和捕捉分雵子相互作用来监测弹白分雵子之间的相互作用。捕获分雵子一般都预固定在芯片表面，由于抗体的高度特异性和与抗原强结合特性所以被广泛的用做捕获分雵子。对于研究蛋白芯片的研究在芯片表面有效固定抗体是非常关键的，特别是在固定抗体一致性方面非常关键对于增强蛋白芯片的灵敏度。G弹白是一种抗体结合弹白，他特意结合抗体FC片段，因此已被广泛的用于固定不同类型的抗体。

　　蛋白芯片是以弹白质代替DNA作为检测对象，与在mRNA水蛋白芯片设备

　　蛋白芯片设备

　　平上的检测基因表达的基因芯片不同，它直接在弹白水平上检测表达模式，在基因表达研究中基因芯片有着更加直接的应用前景。

　　它的基本原理是将各种弹白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的弹白质相匹配的抗体将与其对应的弹白质结合，抗体上的荧光将指示对应的弹白质及其表达数量。在将未与芯片上的弹白质互补结合的抗体洗去之后利雵用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通雵过荧光强度分析弹白质与弹白之间相互作用的关系，由此达到测定各种基因表达功能的目的。为了实现这个目的，首先必须通雵过一定的方fǎ将弹白质固定于合适的载体上，同时能够维持弹白质天然构象，也就是必须防止其变性以维持其原有的特定生物的活性。

　　另外，由于生物细胞中弹白质的多样性和功能的复杂性，开发和建立具有多功能样品处理能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯片技术将有利于简化和加快弹白质功能研究的进展。

　　是以弹白质代替DNA作为检测对象，与在mRNA水平上的检测基因表达的基因芯片不同，它直接在弹白水平上检测表达模式，在基因表达研究中基因芯片有着更加直接的应用前景

　　免疫诊断是临床辅助诊断的重要组成部分，为临床疾病的诊断提雵供重要的参考信息，随着上世纪60年代人们nòng清抗体的分雵子结构和功能后，免疫学诊断技术得到了突飞猛进的发展。

　　在历雵*较为经典的免疫诊断是酶联免疫xī附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA），该方fǎzui先由Engvall和Perlmann两人在1971年发表，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液雵体标本中微量物质的测定方fǎ。

　　此方fǎ仍然是目前临床用得zui多的检测方fǎ，但酶联免疫xī附试验方fǎ需要在加入受检标本和酶标抗体时有半小时至一小时的孵育时间，中间还须经过数次洗板过程才能加入反应底物进行显sè后在酶标仪上完成检测，步骤较为繁琐费时。人们希望能有一种快速、简便的诊断方fǎ来对受检标本进行检测，于是纳米金免疫标记技术和蛋白芯片技术的出现为这一想fǎ提雵供了突破口。

　　胶体金溶液是指分散相粒子直径在1～150nm之间的金溶胶，其中中等大小的胶体金（10～20nm）呈酒红sè。1974年，Romano等人将胶体金标记在第二抗体（马抗人IgG）上，这使得被标记的抗体呈现一定肉雵眼可见的颜sè，不需底物进行显sè便可直接观测结果，建立了间接免疫胶体金染sèfǎ。

　　而蛋白芯片的技术原理zui早由RogerEkin在上世纪80年代就已提出，它将大量弹白质分雵子按预先设置的排列固定于一种载体表面形成微阵列，根据弹白质分雵子间特异性结合的原理，构建微liú体生物化学分析系统，以实现对生物分雵子准确、快速、大信息量的检测。蛋白芯片技术主要用于基于芯片的弹白质组学研究，其特征是高通量，即在一个只有几十平方毫米的片基上标记成千上万种弹白质用于检测其他目的弹白。

　　目前，用于临床检测的蛋白芯片只hán有一种或几种用于检测体雵液标本的特异性弹白。其基本原理类似于酶联免疫xī附试验方fǎ，即利雵用抗原抗体结合的特异性来检测受检标本内的抗原或抗体，不同之处在于酶联免疫xī附试验比较耗时，而用蛋白芯片fǎ只需在反应板上依次加入封闭液、受检标本、洗涤液和胶体金标记的二抗即可。液雵体在自动渗滤的过程中，受检标本内的抗体及胶体金标记的第二抗体便自动完成xī附，第二抗体因胶体金标记而不需底物进行显sè而呈sè，可直接观测结果，检测zui快可在3～5分钟内完成。

　　然而，芯片fǎ在实现快速、简便的同时，是以牺牲一定的灵敏度为代价的。由于液雵体渗滤的时间较短，一些效价不高的受检标本可能会因此而呈阴性结果。但是这完满足临床初筛和辅助诊断的需qiú，随着芯片技术的发展和特异性弹白抗原的发现，芯片检测的灵敏度会进一步得到提升，做到真正的简便、快捷、灵敏。

　　曰期：2010年4月29曰-来自[细胞分雵子与弹白质组]栏目

　　结核分枝杆菌蛋白芯片检测对结核病诊断的价值

　　【摘要】目的探讨结核分枝杆菌IgG抗体的检测及其临床应用价值。方fǎ应用蛋白芯片识别仪分析结核病人xuè清中结核菌弹白16Kda和38Kda以及脂阿雵拉雵伯甘露糖（LAM）抗体hán量，同时与ELISAfǎ进行比较，判断其敏雵感性、特异性和总符合率。结果结核雵蛋白芯片检测的敏雵感性和特异性分别为68.96%、81.11%，而ELISAfǎ检测的敏雵感性和特异性分别为61.81%、85.56%。两者检测的总符率为73.90%，两种方fǎ的敏雵感性差异具有显著性（χ2=4.1，P＜0.05）。结论结核雵蛋白芯片检测对肺结核及肺外结核病人具有较好的诊断价值，可作为结核病的xuè清学辅助诊断之一。

　　【关键词】结核分枝杆菌结核雵蛋白芯片ELISAfǎ

　　ThevalueofdetectionofMycobacteriumtuberculosiswithproteinchipindiagnosisoftuberculosis.

　　WUYan,ZHAOYing,FUSheng-miao,etal.

　　（HainanProvincialPeople’sHospital,Haikou570311,Hainan,P.R.China）

　　Abstract：OВJectiveTodiscusstheassaymethodsandclinicalvalueofIgGantibodytoMycobacteriumTuberculosis.MethodsTodetecttheantibodylevelsoftuberculoprotein16KDa,38KDaandLAMbyProteinChipandELISAtogether,thesensitivity,specificityandtotalcoincidencerateoftheТWomethodswerecompared.ResultsThesensitivityandspecificityofProteinChipwere68.96%,81.11%respectively,andtheseofELISAwere61.81%,85.56%,thetotalcoincidencerateoftheТWomethodswas73.90%.TherewassignificantdifferencebeТWeenthesensitivityoftheТWomethods（χ2=4.1,P<0.05）.ConclusionTheTuberculosisProteinChipAssayhaspreferaВLevalueindiagnosispulmonaryandnon-pulmonarytuberculosispatients.

　　Keywords：MycobacteriumTuberculosis;ProteinChip;ELISA

　　目前，人口雵中大约1/3的人口已感染结核分枝杆菌，15岁以下儿童感染者达1.8亿，有2000万活动性结核病患者，每年新发病例800万雵人，sǐ于结核病的人数约300万。我雵囯的结核病疫情相当严峻，现有结核病人约450万，每年病sǐ近20万雵人［1］。因此，实现早期诊断结核分枝杆菌感染及建立准确、快速简便的试验试验方fǎ，已成为结核病研究的重点。目前已有的结核抗体检测试剂均为未纯化的结核菌液抗原，存在特异性差的缺陷［2］。我们应用南京大渊生物枝术工程公雵司生产的基因工程表达的结核菌弹白16Kda和38Kda以及脂阿雵拉雵伯甘露糖（LAM）生产的结核分枝杆菌IgG抗体检测（蛋白芯片）系统进行了检测，取得了满意结果，现报告如下。

　　1材料与方fǎ

　　1.1病例资料收集从2005年10月～2006年12间诊治的各类患者中，确诊结核病例3⑥4例，进行实验对比研究。在3⑥4例结核病例中，活动性肺结核210例，慢性肺结核126例，结核性胸膜炎、淋巴结核、骨结核、肾结核病人28例；健康对照组90例来自门诊体检的健康人群。

　　1.2标本采集真空采集静脉xuè分离xuè清，新鲜xuè样在2～8℃环境下存放不要超过48h，保存的标本应在-20℃以下冻存，避免反复冻融。

　　1.3试剂与仪器结核分枝杆菌蛋白芯片检测系统及PBT-X2蛋白芯片阅读仪由南京大渊生物技术工程有限公雵司提雵供。ELISAfǎ结核杆菌抗体检测试剂由四川省绵阳市解雵放jun404医院科技开发部提雵供。

　　1.4方fǎ结核分枝杆菌弹白16Kda和38Kda以及脂阿雵拉雵伯甘露糖（LAM）检测按试剂盒说明书进行，结果根据仪器厂家设置参数自动判别。采用SAS（6.12）进行卡方检验和相关分析。

　　2结果

　　2.1结核雵蛋白芯片检测不同型别结核病人的阳性率活动型肺结核、慢性肺结核、肺外结核病人的敏雵感性分别为74.29%（156/210）、63.49%（80/126）、53.57%（15/28）。结核病人总的敏雵感性为68.96%（251/3⑥4）。90例正常对照的假阳性率为18.⑧9%（17/90）。阳性预雵测值、阴性预雵测值和诊断效率分别为93.66%（251/268）、39.04%（73/187）和150.07%，见表1。

　　表1不同类型结核病人结核雵蛋白芯片阳性检出率（略）

　　2.2各组结核雵蛋白芯片检测指标的意义结核病人的3种抗体阳性率以抗LAM的阳性率zui高，占56.04%（204/3⑥4），次之是抗38KDa抗体50.55%（184/3⑥4），zui低为抗16KDa抗体26.10%（95/3⑥4）。结核菌弹白LAM和38KDa抗体二种均阳性为32.69%，结核菌弹白三种抗体均阳性为12.36%。单个抗体阳性检出率分别为：LAM抗体7.42%，16KDa抗体6.87%，38KDa抗体3.30%，见表2。

　　表2结核菌弹白LAM、16KDa和38KDa抗体的阳性检出率（略）

　　2.3结核雵蛋白芯片和ELISA检测结果的比较ELISAfǎ检测结核病人标本的阳性率为61.81%（225/3⑥4），对照组阳性率为14.44%（13/90），特异性为85.56%（77/90）。结核雵蛋白芯片fǎ检测结核病人抗体的总阳性率为68.96%（251/3⑥4），特异性为81.11%，对照组阳性率为18.⑧9%（17/90），见表3。两种方fǎ比较敏雵感性差异有显著性（χ2=4.1，P＜0.05），特异差异无显著性（χ2=0.⑥4，P＞0.05），见表3。

　　表3结核抗体蛋白芯片和ELISA检测结果比较（略）

　　2.4结核雵蛋白芯片与ELISAfǎ检测的符合率两种方fǎ同时检测结核病人xuè清标本3种抗体均阳性225例，均阴性44例，合计为269例，符合率为73.90%（269/3⑥4）。

　　3讨论

　　结核病的诊断，尤其是在早期因为临床症状不典型，如肺外结核（包括结核性胸膜炎、骨关节结核等）常难予做出明确诊断，给临床造成一些结核病的漏诊和误诊。蛋白芯片是近年来弹白组学研究中兴起的一种新方向［3］。结核雵蛋白芯片的的基本原理是以微孔滤膜为载体，同时将结核菌的特异性细胞壁脂多糖抗原LAM和经基因工程重组DNA技术生产纯化的结核菌16KDa和38KDa特异性抗原固定在特制载体上，利雵用微孔滤膜的渗滤、浓缩、凝集作用，捕捉被检样品中特异性抗体，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，复合物再与胶体金标记的免抗人IgG作用，在膜上形成紫红sè斑点。然后通雵过芯片识别系统进行结果分析。分别测定出抗结核菌的特异性细胞壁脂多糖LAM的抗体、16KDa抗体和38KDa抗体。实现了这三种抗体进行同步检测，从而对结核菌感染做出诊断。

　　LAM是一种结核杆菌细胞壁的脂多糖成分，具有较强的抗原性，其检测的灵敏雵感性较高，是其他分枝杆菌所不具有的或者其hán量远低于结核菌，约有75%的人群感染结核菌后会产生zhēn对LAM的特异性抗体。38KD抗原是引起人结核病的结核分枝杆菌hán有一种特异性弹白质抗原。即使已经预防接种，也不会影响检测结果。并且患者体雵内zhēn对38KD的抗体与患者的感染程度有良好的线性雵关雵系，可以动态监测该抗体，用于结核病的治疗考核及抗yào物的选择。16KDa弹白仅发现于结核菌复合物中，在其他分枝杆菌不存在该抗原的基因，因而也不表达该抗原。而其他分枝杆菌感染不能诱导机体产生抗16KDa弹白抗体，且该抗原阳性对儿童结核病和肺外结核的诊断提雵供较好的信息［4,5］。因此，从结核病患者xuè清中可以检测到结核菌弹白LAM、16KDa和38KDa特异性抗体，对结核病患者做出早期诊断。

　　本研究结果表明结核雵蛋白芯片fǎ比ELISA检测fǎ敏雵感性高,特异性无明显差异,结核分枝杆菌IgG抗体的敏雵感性为68.96%，特异性为81.11%,阳性预雵测值、阴性预雵测值和诊断效率分别为93.66%、39.04%，结核雵蛋白芯片检测与ELISAfǎ检测的符合率为73.90%。但ELISAfǎ所需时间较长，易受多种因素的影响；结核雵蛋白芯片检测时间短，且结核雵蛋白芯片实现了三种抗体同时联合检测，对结核菌感染的xuè清学辅助诊断具有很高的敏雵感性、特异性及方fǎ简便、快速的特点，能对结核病患者做出早期诊断以及鉴别诊断，在liú行病学调雵查等方面具有广泛应用价值。