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重组人乙酰胆碱酯酶治疗有机磷效果研究
2013-11-27 阅读(723)
对重组人乙酰胆碱酯酶其分子特性和生物学特性进行筛选。
为进一步rhAChE的体内研究及临床应用奠定基础,从而为有机磷中毒开辟新的治疗途径。 根据疼痛基因库的基因序列，用引物primier5软件和合成正常流产哈赫基因特异性扩增引物设计，胎儿大脑总RNA提取的RNA为模板，,利用RT-PCR技术扩增出hAChE ,将纯化的PCR扩增产物与克隆载体pUCm-T连接,构建克隆表达载体,将其命名为pUCm-T/AChE,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经IPTG诱导培养,白色菌落筛选，质粒DNA小量提取，测定并分析了消化和双酶序列的PCR鉴定。
用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切克隆载体pUCm-T/AChE,回收AChE基因片段,并与经同样酶切的pET-28a（+）表达载体连接,构建重组质粒,将其命名为pET-AChE,转化大肠杆菌BL21中,通过Kan+筛选阳性质粒,进行PCR鉴定,将BL21（pET-AChE）工程菌经IPTG诱导表达,将诱导及未诱导的工程菌全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。根据改良埃尔曼法（比色法）人血乙酰胆碱酯酶和rHAChE活性检测，比较。
重组人乙酰胆碱酯酶治疗有机磷研究结果。
采用紫外分光光度计测量的总RNA提取，OD260／od2801.8，OD260／od2701.2，表明游离酚残留蛋白。取lulRNA样品做甲醛变性凝胶电泳可见28S和18SRNA两条带,说明RNA基本完整。克隆的hAChE编码序列为1845bp,与GenBank DNA数据库中人乙酰胆碱酯酶基因序列一致。构建了克隆表达载体pUCm-T/AChE和重组表达载体pET-AChE。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明，分子量约为68.2kda rHAChE，0.75mg/ml的浓度。
