细菌、放线菌的生长繁殖对pH一般要求偏碱，霉菌和酵母菌要求偏酸。因此，分离培养基的pH应该调节到被分离微生物要求范围。这不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。

    分离碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时，可以把培养基调到pH9～11，在此范围内不宜生长的微生物被抑制，这对分离培养基本身起到浓缩作用。大多数水解酶的生长zui适pH基本相近，而酶的作用pH未必与产酶pH相同。

    培养基的pH要结合营养成分和培养条件来考虑。因为微生物在生长繁殖过程中，由于代谢作用会产生酸性或碱性产物，pH发生变化，微生物生长受到抑制。一般培养基中碳氮比高者，培养后倾向于酸性，反之则倾向于碱性。无机盐的性质也会影响pH变化， 2SO4是生理酸性无机氮源，其中NH4+被菌体利用，留下SO42—，培养液变成酸性。而NaNO3是生理碱性氮源，其中NO3—被菌体分解利用后，剩余Na+，使培养液变成碱性。如发酵过程缺氧，则代谢向有机酸合成方向进行，pH下降。为了维持培养基的ph，一般要加磷酸盐，如K2HPO4、KH2PO4，使培养基具有一定的缓冲能力。如果培养液中的酸碱变化很大，磷酸盐的缓冲容量不足以调节pH变化，则可适当加入碳酸钙，以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类，使培养基的pH能保持在恒定的范围内。此外，在分离霉菌时，加几滴乳酸不仅可以维持一定酸碱度，而且可以抑制细菌的生长。