三羧酸循环系列_柠檬酸(CA)含量测试盒
测定方法：微量法
产品规格：100管/96样
注 意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环步反应的产物。
测定原理：
酸性条件下，柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。
三羧酸循环系列_柠檬酸(CA)含量测试盒
自备仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
试剂组成和配置：
试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体×1管，－20℃保存。
试剂四：粉剂×1管，室温保存。临用前配制，加入2mL试剂一，充分溶解。
试剂五：液体×1管，4℃避光保存。
标准品：液体×1管，250μmol/L柠檬酸标准液，4℃保存。
样品中柠檬酸提取：
1.液体样品中柠檬酸提取：取0.1mL液体加试剂一0.9mL，充分混匀，11000g， 4℃离心10min，取上清液，待测。
2.组织中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
3.线粒体中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，600g/min，4℃离心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃离心10min，弃上清（此上清液可用于细胞质CA含量测定）；向沉淀中加试剂二200μl，以及试剂三2μl，充分悬浮溶解，11000g，4℃离心10min，取上清液，待测。
4.细菌、真菌中：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到545 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一置于30℃水浴中预热30min。
3. 空白管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL蒸馏水，140μL试剂一，20μL试剂四，20μL试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A空白管。
4. 标准管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL标准液，140μL试剂一，20μL试剂四，20μL试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A标准管。
5. 测定管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL上清液，140μL试剂一，20μL试剂四，20μL试剂五，充分混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A测定管。
注意：空白管和标准管只需测定一次。
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