一、骨髓瘤细胞的制备

1．骨髓瘤细胞特征骨髓瘤细胞系和免疫动物应属同一品系，这样杂交瘤融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：SP一2／0、NS1、X63、Ag8．653等，本章以SP一2／0为例。骨髓瘤细胞是经过8一氮*(8一azaguanine，8-AG)、5一溴脱氧尿苷(5一brom-2-deoxy uridine，5一BrdU)或6一巯*(6一thioguanine，6一TG)筛选而得到的遗传基因缺陷型的细胞系，骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤一*磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphcnbosyl transferase，HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(tlaymidine Kinase，TK)。因此，当骨髓瘤细胞主要合成途径被氨基蝶呤(aminopterin)阻断，由于其缺乏上述两种酶，从而导致骨髓瘤细胞在HAT次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶(T)培养系统中的死亡。

    一般在融合前2周就应开始复苏骨髓瘤细胞，生长良好的细胞在倒置显微镜下观察为圆形明亮、排列整齐、形态完整、浓度适宜(zui大密度不得超过106个／ml)。一般扩大培养以l：10稀释传代．每3～5d传代一次。实验室培养的骨髓瘤细胞每3～6个月应用8一AG筛选一次，以除去HGPRT回复突变的细胞。

2．骨髓瘤细胞悬液的制备方法

1)于融合前36～48h，将骨髓瘤细胞扩大培养(一般按一块96孔板的融合试验约需2～3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备)。

2)融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。

3)1000r／min离心5～10min，弃去上清液。

4)加入30ml不*培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不*培养基，混匀。

5)取骨髓瘤细胞悬液，加0．4％台盼蓝染液做活细胞计数后备用。

二、免疫脾细胞的制备

    免疫脾细胞指的是处于免疫状态的脾脏中B淋巴母细胞一浆母细胞。一般取zui后一次加强免疫3d以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不*培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×lO4左右。

三、饲养细胞的制备

    在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加人的活细胞称为饲养细胞。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞等。取与免疫小鼠相同品系的6～10周龄小鼠，颈椎脱臼处死，腹腔内无菌注射10～15ml*培养液，拇指轻揉腹部数次后慢慢抽回液体，1000r／min离心5～10min．弃上清液。加人HAT培养基，调整细胞浓度为2×105／ml，加入96孔板，100gl／孔，放人37℃5％CO2的培养箱中培养。一般饲养细胞在融合前1～2d制备，一只小鼠可取lO7个巨噬细胞。

四、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

1.取对数生长的骨髓瘤细胞，1000r／min离心5min，弃上清液．用不*培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不*培养液洗涤2次。

2．同时制备免疫脾细胞悬液，用不*培养液洗涤2次。

3．将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：(5～10)的比例混合，加入不*培养液，1200r min离心8min，弃上清液。在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置37℃水浴中预热。

4．吸取37℃预热的PEG(pH 8．O)1ml，缓缓滴人离心管，1min内加完。

5．滴加37℃预热的不*培养基1ml，lmin内加完，然后加*培养基至50ml．终止PEG的作用。

6．1000r／min离心5min，弃去上清液。将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HAT培养基中，接种24孔板或96孔板，置37℃，5％CO2培养箱内培养。

7．5d后用HAT培养基换出1／2培养基。

8．7～10d后用HT培养基换出HAT培养基，第14d后可用普通*培养基。

9．经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至7L底面积1／10以上时吸出上清液供抗体检测。