间接法又称为荧光抗-抗体法
? 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
–  可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。

?间接免疫荧光法操作步骤
?  标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；
?  一抗染色：
–  加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37?C作用30min或4?C过夜。
?  0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；
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间接免疫荧光法操作步骤(续)
?   加荧光标记的二抗抗体，37?C湿盒避光作用30min。
?  0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；
?  甘油缓冲液封片
?  镜检

?  优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；
?  缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。

?间接免疫荧光法的注意事项
?  荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。
?  每次试验时 ，需设置以下三种对照：
–  阳性对照：阳性血清+荧光标记物
–  阴性对照：阴性血清+荧光标记物
–  荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
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间接免疫荧光法的注意事项(续)

?  标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
?  一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。