F/P比值的测定方法

    F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为1~2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，敏感性降低。

（1）蛋白质定量  测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。

（2）结合荧光素定量  先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC 1mg，溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/L pH7.2 PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10μg/ml。以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光光度计在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横座标，作标准函数图。荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm，FITC和蛋白质结合后由490nm变为493-495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。

F/P比值的计算：

    F/P克分子比值=（FITC  g/ml）/（蛋白质mg/ml）×（160000×103）/（390×106）=0.41×（FITC  g/ml）/（蛋白质mg/ml）

    式中160000为抗体蛋白质的分子量，390为FITC的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103，而荧光素从克换算为微克需要再乘以106。

测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下：

    RB200荧光抗体的克分子比值=[（RB200 g/ml×10-3）/580]/[（蛋白质mg/ml）/160000（IgG）]

    TMRITC荧光抗体克分子量比值=A515nmOD/A280nmOD 或=重量比（g/g）×（160000/580）