乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是细胞能量代谢(糖酵解)中的一个重要的酶，可以催化乳酸生成丙酮酸，同时产生ATP。正常情况下LDH不能透过细胞膜，但当细胞受损或死亡时，细胞膜通透性增强，LDH会从胞浆中露出，细胞质内LDH减少，培养液中LDH增多。因此LDH是质膜完整性的标志，也是检测细胞活性的指标，培养液中LDH越高就说明细胞损伤越严重。

    LDH在有辅酶I携带氢的情况下，催化乳酸与丙酮酸之间的可逆反应。在pH 10的条件下，以乳酸为基质，经LDH作用后，测定生成的丙酮酸量，从而推知LDH的活性。

(一)材料

1．96孔培养板培养的待测细胞和对照细胞培养上清液。

2．0．1mol／L*缓冲液、甘油酸7．505g、NaCl 5．85g，溶于双蒸水至1000ml。

3．缓冲基质液(pH 10．O)：70％*10ml，0．1mol／L*缓冲液125ml，0．1mol／L NaOH 75ml，加氯仿数滴防腐，4℃保存备用。

4．辅酶I溶液：辅酶I 10mg溶于2ml双蒸水中，4℃保存备用。

5．2，4一二硝基苯肼溶液：20mg 2，4一二硝基苯肼溶于10ml 10mol／L HCl中后，用蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。

6．丙酮酸标准液：准确称取干燥至恒重的丙酮酸11mg，用0．1mol／L H2SO4溶解后定容至100ml，4℃保存备用。此标准液相当于lμmol／L丙酮酸。

(二)方法

1．绘制标准曲线，按表8-1操作。

    将各试管置于37℃水浴15min后，各管加入0．4 mol／L NaOH 10ml，混匀后室温放置5min，以1号管为空白，将试管分别于440nm测定各孔光吸收值，记录结果。以LDH量为横坐标，各管吸光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2．培养液中LDH测定，操作见表8—2。

(三)结果分析

    混匀后室温下放置5min，以对照管为空白，440nm比色。根据标准曲线确定细胞培养液中的LDH活性。本法操作简便快捷，自然释放率低，可用于CTL及NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，现已有LDH法测定CTL活性试剂盒。

(四)注意事项

1．各管吸光密度值若过高，应对细胞培养液进行稀释。

2．确保每管的反应时间一致。