一、载体的构建

    外源基因往往不能独立复制，需要与一个复制子相连接，使它能被引入宿主内并能在其细胞内复制。在重组DNA技术中担负基因转移任务的复制子叫载体(vector)。

一个理想的载体通常应具备下列特征。

①能在宿主细胞中独立复制，或者能有效地协助外源基因整合到宿主染色体上，使外源基因可以随宿主染色体一起复制。

②容易进入宿主细胞。

③有一定的选择性标记，易于识别和筛选。

④可插入一段较大的外源DNA，而不影响其本身的复制。

⑤有合适的限制酶位点便于进行克隆。

    另外，还应具有较好的安全性、易制备、多拷贝、易于表达等特点。重组DNA技术中所用的载体主要是质粒和温和噬菌体(见转导)两类。为了实现目标基因的复制和表达，宿主和载体缺一不可，而且不同的宿主需要不同的载体，两者相辅相成，构成完整的宿主一载体系统。这里主要以大肠杆菌和酵母菌宿主为例介绍常用载体。

1. 以大肠杆菌为宿主的载体

    以大肠杆菌为宿主的体系，常用的载体有质粒载体、噬菌体载体以及由它们组合而成的复合型载体(柯斯质粒、噬菌粒)等。

(1)质粒载体质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作人工构建而成的。与天然质粒相比．质粒载体通常具有以下特点。

①带有一个或几个选择性标记基因(如抗生素抗性基因)。

②带有一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列。

③去掉了大部分非必要序列，使分子量尽可能减少。

④往往还带有一些多用途的辅助序列。

    常用的质粒载体大小一般在1～10kb，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescrjpt(简称pBS)系列等。以pUCl9为例，它的大小为2686bp．带有一个复制起始位点、一个*抗性基因、一个大肠杆菌乳糖操纵子β一半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码n一肽链的DNA序列组成的lacZˊ基因、一个调节缸lacZˊ基因表达的阻遏蛋白(repressor)基因如lacI，以及位于lacZˊ基因中靠近5ˊ端的一段多克隆位点，在该多克隆位点插入外源基因后，将破坏lacZˊ基因，使其不能正常表达(图6．5)。筛选含pUCl9质粒细胞的过程比较简单：如果细胞含有未插入目的DNA的pUCl9质粒，在同时含有诱导物IPTG和X—gal底物的培养基上培养时将会形成蓝色菌落；如果细胞中含有已经插入目的DNA的pUCl9质粒，在同样的培养基上培养将会形成白色菌落。因此，可以根据培养基上的颜色反应十分方便地筛选出重组子。一个与pUCl9质粒十分类似的质粒是pUCl8，两者的差别仅在于多克隆位点的插入方向彼此相反。

(2)噬菌体载体 重组DNA技术中常用的噬菌体载体主要有x噬菌体和一些单链DNA噬菌体(如M13噬菌体)。

    野生型的λ噬菌体DNA含有多个常用限制酶切点，不宜作为载体。经过研究人员的多年努力，目前已经成功地构建了多种λ载体，这些载体可分为两类。

①插入型载体(insertion vector)，它具有单一的酶切位点，可供外源DNA的插入。

②置换型载体(replacement vector)，它具有成对的酶切位点．两个酶切位点之间的DNA片段可被外源DNA片段置换。

    由于λ噬菌体颗粒有效包装DNA的长度范围为野生型长度的78％～105％，也就是38～52kb，而λ噬菌体裂解生长必需基因组就占了28～30kb，冈此可克隆的zui大外源DNA长度约为24kb。一般插入型载体可克隆的zui大外源DNA长度在10kb以下，而置换型载体可克隆的外源DNA长度在9～24kb之间。λ噬菌体载体在DNA文库的构建中非常有用。

    在大肠杆菌中，还存在一类丝状噬菌体，如M13、fl和fd等，其噬菌体颗粒中包装的是单链(正链)的DNA。这类特殊的噬菌体在分子生物学中具有*的地位。现在，M13噬菌体已经被发展成为一种通用的克隆载体。与上述载体相比，M13噬菌体载体的一个突出优点是，可以方便地获得含目的基因的单链DNA。这种单链DNA可广泛应用于核苷酸序列测定、探针制备和寡核苷酸定点突变等。

(3)柯斯质粒(cosmid) 柯斯质粒，又称黏粒，是由大肠杆菌质粒中插入λDNA的包装识别序列cos位点构建而成。它是一种特殊的质粒载体。大多数常用的柯斯质粒载体大小约为6kb，因此它可克隆的外源DNA片段长32～46kb，比λ 噬菌体载体可克隆的片段大了约一倍。柯斯质粒同时具有质粒和x噬菌体载体的某些特性。

(4)噬菌粒(phagemid) 另一类由质粒和噬菌体组合而成的特殊质粒载体称为噬(菌)粒。噬菌粒是以普通质粒载体与丝状噬菌体M13或f1等为基础构建的，在质粒中插入了包括丝状噬菌体DNA合成起始和终止的顺式作用信号及丝状噬菌体颗粒装配所需的序列等丝状噬菌体主要基因，它同时具有质粒和丝状噬菌体的特征，因此称为噬(菌)粒(phagemid或phasmid)。与M13噬菌体载体相比，噬菌粒分子量小、克隆能力大、遗传也更稳定。与普通的质粒载体相比，噬菌粒的主要优点是容易得到单链DNA。由pUCl8／19质粒发展而来的pUCll8／119质粒就是典型的噬菌粒载体。

(5)大容量克隆载体 细菌人工染色体(bacterial artificial chlromosome，BAC)是以大肠杆菌致育因子(F因子)为基础构建的合成载体，含F因子复制的起始基因和定向基因(oris和repE)。其特点为：拷贝数低，稳定，克隆的外源DNA的平均大小约120kb，个别BAC可克隆zui大达300kb的基因组DNA。BAC可以通过电穿孔导人细菌细胞，其不足之处是对无选择性标记DNA的产率很低。P1人工染色体(P1 artificial chlromosome，BAC)是结合BAC和P1噬菌体载体的优点而开发的克隆体系，可以包含60～150kb的外源DNA
片段。

(6)表达载体根据载体的不同用途，还有克隆载体和表达载体之分。克隆载体是指以繁殖DNA片段为目的的载体。这种载体一般本身较小，但可携带较大的外源DNA片段．在细胞内的拷贝数较高。表达载体则是用来将克隆的外源基因在寄主细胞内表达成蛋白质的载体。

    大肠杆菌表达载体通常具有强而可控的启动子、转录终止子、翻译起始序列、翻译增强子和翻译终止子等与基因表达有关的序列。其中启动子是决定基因表达水平的关键因素。也是构建表达载体时优先考虑的环节．表达载体的启动子应在宿主中具有很强的启动效率。大肠杆菌表达载体常具有大肠杆菌乳糖操纵子的lac启动子、*操纵子的trp启动子、λ 噬菌体的PL启动子或者一些复合启动子等。其次，有些表达载体自身不带抑制物基因，使用这类载体时选择能产生抑制物蛋白的宿主菌，否则目的基因的表达不能调控，不利于表达。另外，用表达载体获取蛋白质产物时还要考虑宿主菌是否合适，因为很多宿主菌往往含有蛋白酶，会对表达产物产生降解作用。因此，用作基因表达的宿主菌一般都要经过改造，使其蛋白酶基因缺失或失活，以便于表达产物的积累。